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- 【导读】用于流式细胞仪检测的常用荧光素有FITC、TRITC、Cy3、Cy5,PE和PI,在以上各种荧光染料中,PE荧光最强,适用于弱表达抗原;FITC最便宜,适用于强表达抗原,适用范围广...
用于流式细胞仪检测的常用荧光素有FITC、TRITC、Cy3、Cy5,PE和PI,在以上各种荧光染料中,PE荧光Z强,适用于弱表达抗原;FITCZ便宜,适用于强表达抗原,适用范围广。
1.直接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(浓度约l×l06个/m1),直接加入荧光素标记抗体进行免疫反应(如做双重标记或多重标记染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)。4℃孵育15~30分钟后,用l/15mol/LPBS(pH7.2~7.4)洗l~2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直接荧光抗体标记试剂成本较高。但减少了间接标记法中较强的非特异荧光干扰,因此更适用于临床标本的检测。2.间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(浓度约5×106个/m1),加入特异性diyi抗体,4℃孵育15~30分钟,待反应完全后用磷酸缓冲液洗去未结合抗体,吸尽残留液体,再加入荧光标记第二抗体,4~C孵育30分钟,生成抗原抗体抗抗体复合物,洗涤后即可上机检测。注意:在整个荧光标记过程中均需参考免疫荧光细胞化学间接法染色程序,尤其是加入一抗前需使用正常非免疫血清封闭,以减少非特异性反应。如果对于未经固定的细胞需使用0.3%TritonX-100为细胞膜打孔,以保证抗体能够进入细胞内。此法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研样品检测。但是,由于非特异性荧光背景较强,影响实验结果,在样品制备时应加人阴性或阳性对照。另外,由于间接法步骤较多,尤其是经过多次洗涤,均可使细胞数量骤减,因此,在加入diyi抗体前细胞悬液的细胞浓度约5×10‘个/ml,上机检测前不少于1×106个/ml即可,此法不适用测定细胞数较少的样品。3.荧光标记中的注意事项(1)为减少非特异性干扰,荧光标记物用前应用0.22um滤膜过滤或高速离心5分钟,以除去颗粒或沉渣。(2)细胞样品的制备、染色及保存均应该尽量保持新鲜,防止分解代谢引起的表面抗原消失及细胞死亡,可以通过加入营养培养基或低浓度血清以及4~0或冰浴中操作来解决。(3)细胞稀少或低比例细胞亚群分析时,为保证准确,应排除死细胞。(4)荧光标记抗体浓度应该合适,如果浓度过高,会使非特异性结合增加。在使用一抗之前,将样品与过量的牛血清白蛋白(BSA)或来源于同一种属的正常血清一起孵育,以阻断一抗和细胞表面或胞内结构非特异性作用。在使用一抗之后,将样品、与二抗相同种属的5%~10%正常血清和二抗一起孵育,以减少二抗与一抗、细胞表面或胞内结构之间的非特异相互作用。如果使用含有与一抗或二抗种属相同的血清液体稀释抗体,便可以省略此步骤。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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