WM-115细胞，传代细胞培养

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[实验步骤1]

1、准备工作：1）肥皂洗手，在进行无菌操作前，用75%的酒精擦拭双手，注意指间，和指甲周围。同时，用酒精棉球擦拭超净台。

2）将培养液放置室温，备用。

3）打开超净台内的紫外灯，照射20min。同时，将实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）

4）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。

2、关闭超净台的紫外灯，打开风机。

3、点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用。

4、在打开培养瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再用吸管轻轻吸出旧的培养液，注意，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。

5、将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失，变圆时，立即翻转培养瓶，吸出胰酶。记住不要消化时间过长，否则，细胞会被胰酶消化掉。

6、加入适量Hanks液或培养基清洗一遍，立即倒掉。

7、加入含有10%血清的培养基，用吹打管吹打，一定要轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，再补加培养基，按1:3进行分瓶。然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，放到培养箱中进行培养。以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法，对于悬浮细胞的传代培养方法，只需要将细胞进行离心，1000rpm，5min,然后，换入新的培养基即可。再分装到不同的培养瓶中进行培养。不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形，不规则，失去原有的特点。

是否污染：传代或换液24~48h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞。实验四、细胞冻存与复苏WM-115细胞，传代细胞培养

[实验步骤2]

1.为了保证细胞良好的状态，在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期，同时将细胞换液，次日，按照细胞传代培养方法，用胰酶消化贴壁细胞，将细胞用培养基冲下来，然后，用50mL尖底离心管离心，1000rpm，4min，弃上清，收集细胞。

2.加入适量的冻存液（10%DMSO和90%含有20%血清的IMDM培养基）

3.分装到冻存管中，做好标记，标明细胞名称，保存时间，所用培养基等。

4.4℃放置30min；-20℃放置1.5h；-70℃放置12h；Z后移到液氮罐中。细胞的复苏：细胞的复苏原则是快速溶化，因为如果缓慢的溶化，会使进入细胞的水分形成冰晶，对细胞造成伤害，因此，在复苏细胞时，将冻存细胞直接放到37℃的水浴中，使其迅速溶解。在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接倒入小培养瓶或培养皿内，然后，加入3mL的培养液。次日，观察细胞生长情况，并更换细胞培养液。

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