大鼠肝星状细胞原代培养实验

大鼠肝星状细胞原代培养可以：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因ZL研究。

将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

SD大鼠

钠小牛血清DMEM酶消化液D-Hanks'液酚红台盼兰HBSS氯化钠PBS

手术刀手术剪尼龙网相差显微镜荧光显微镜

一、实验材料准备

1.动物：雄性SD大鼠(体重250-450g)。

2.试剂：钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18%Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks'液(KCl0.4g/L，KH2PO40.06g/L，NaCl8.0g/L，NaHCO30.35g/L，Na2HPO4.7H2O0.06g/L或Na2HPO40.053g/L，可加酚红0.02g/L)，HBSS，台盼兰等。

3.器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。

二、原代培养方法

1.大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100ml酶消化液I(0.05%IV型胶原酶)。

2.待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20U/mlDNaseI的0.05%IV型胶原酶)消化15min，尼龙网过滤后以450g离心5min(4℃，下同)。

3.以HBSS重悬沉淀至10ml，再混以20mlNycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3mlHBSS，1450g离心16min后取界面细胞。

4.以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，Z后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。

三、传代方法

弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代Z好加0.05%EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5min左右)，以完全培液(DMEM+10%NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。

四、结果

接种次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328nm处见自发荧光。

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