细胞培养实验中需要的材料

1.种类

1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。

1.2.TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。

1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

1.4.塑料离心管:15ml,50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene（PP）为不透明材质，polystyrene（PS）为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。

1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。

1.6.玻璃血清瓶（PyrexorDuranglassware）：100ml,250ml,500ml,1000ml

2.清洗和灭菌

2.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。

2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。

2.3.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃,15lb,20分钟，置于oven中烘干。

2.4.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170℃,4小时。

2.5.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液（次氯酸，即漂白水）或是蒸汽高压灭菌121℃,15lb,20分钟处理。

3.培养基

1.液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。

2.液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

3.粉末培养基配制（以1升为例）：

3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH），因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

3.2.材料：

3.2.1.纯水（milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要）

3.2.2.粉末培养基

3.2.3.NaHCO3（SigmaS-4019）

3.2.4.电磁搅拌器

3.2.5.无菌血清瓶

3.2.6.0.1或0.2mm无菌过滤膜

3.2.7.pHmeter

3.2.8.真空帮浦

3.2.9.CO2气体

3.3.步骤：

3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。

3.3.2.称取适量之NaHCO3粉末（数量依培养基种类而异，表一）溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。

3.3.3.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。

3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。（血清亦可加入培养基中一起过滤）

3.3.5.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

4.配制培养基之生长测试

4.1.材料：

4.1.1.MDCKcell（ATCCCCL-34或CCRC60004）4.1.2.6-wellTCplate（or35mmTCdish）

4.1.3.methanol

4.1.4.glacialaceticacid

4.1.5.10%Giemsasolution（GibcoBRL10092-013）

4.2.步骤：

4.2.1.以待测试培养基培养MDCKcell，接种MDCK细胞于6-wellplate（或35mmTCdish）中，每个well接种1×102活细胞，同时作对照组实验。

4.2.2.接种5～7天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。

4.2.3.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸?3:1），室温下静置10min。

4.2.4.去除固定液，水洗二次。

4.2.5.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

4.2.6.去除染液，水洗二次。

4.2.7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。

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