细胞培养实验室中支原体污染的特点及检验方法

在细胞培养实验室，细胞支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个很大的难题。掌握支原体感染的特点，并及时做好预防和处理，可避免细胞支原体感染。

支原体污染的特点

1、支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(Z小直径0．2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。

2、支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其ZX有电干密度大的密集颗粒群或丝状的ZX束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且ZX无颗粒群或ZX束。

支原体污染的检测方法

1.相差显微境检测

将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。

2.荧光染色法

荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的 Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1-2min，向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

3.电镜检查

用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。

4.DNA分子条文检查或支原体培养等方法

支原体污染预防及处理

组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：

控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。

当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体Z有YZ活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。