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      近年来肿瘤免疫ZL取得了一系列突破性成果，成为继肿瘤手术ZL、放化疗及靶向ZL之外的革命性ZL手段，特别是基于PD-1、CTLA-4等免疫检查点YZ剂的ZL方案表现尤为突出。即便如此，肿瘤的免疫ZL仍面临巨大挑战，如LX不确定性、总体有效率低、耐药抵抗及检测生物标志物缺乏等都制约了对患者的jing准ZL。

      大量的临床案例和科学研究表明肿瘤免疫微环境的深度解析将会是突破免疫ZL障碍的关键所在，独特的Phenoptics分析方案可以wan美的解决这一难题。该方案可以实现对肿瘤样本内多达9种生物标志物的原位标记和描绘，同时实现多种生物标志物的联合分析及空间分布分析，从而实现生物学数据的深度挖掘，为肿瘤jing准诊疗提供重要依据。   

接下来跟随小编一起来看几篇发表在杂志的相关研究论文，一探究竟吧！

1、JAMA Oncology

      2019年7月18日来自美国约翰霍普金斯大学、耶鲁大学、范德堡大学及西北大学等科研单位联合在肿瘤学权威期刊JAMA Oncology(IF 22.4)发布了一项肿瘤学免疫诊疗重要研究成果(Comparison of Biomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1 Checkpoint Blockade A Systematic Review and Meta-analysis)，系统阐述了利用Phenoptics免疫标志物mIHC/IF多重免疫组化(即Opal多重免疫组化)分析方案对于肿瘤微环境进行深度分析，其结果对比传统检测手段对于LX预测有着更为突出的优势，可以更好地为肿瘤的诊断和免疫ZL提供可靠依据。

文章对比了广泛应用的几种肿瘤学生物标志物检测方案，如传统PD-L1免疫组化检测、TMB肿瘤突变负荷分析、GEP基因表达谱分析及mIHC/IF多重免疫组化检测等方案与临床案例的诊断准确性及免疫ZL应答率进行了深度整合分析。

      研究人员通过Meta分析统计了2013年-2018年间公开发表及重大学术会议公布的肿瘤免疫ZL及免疫检查点YZ剂56篇研究案例，包含 10种以上不同类型的肿瘤样本总计8135份的完整临床数据(包括黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌、头颈癌、结肠癌、肝细胞肝癌、宫颈癌、胃癌、默克细胞瘤、肾细胞癌等)，系统关联分析了肿瘤ZL应答率和生物标志物的表达水平，根据其比值权重依据敏感性和准确度统计出sROC曲线并分析计算曲线下面积AUC数据进行准确度评估用于判断该检测方案的敏感度和特异度，这两项指标与肿瘤的免疫ZL应答率具有高度相关性。

      数据统计分析显示，mIHC/IF多重组化检测方案的数据结果权重分析条件下AUC=0.79显著优于其他分析方案，PD-L1传统免疫组化IHC检测(AUC=0.65,P<0.001),GEP基因表达谱分析(AUC=0.65,P=0.003),TMB肿瘤突变负荷分析(AUC=0.69, P=0.049)，非权重分析AUC=0.872依然显著高于其他分析方案的统计数据。而在使用多个分析方案进行多参数联合评估条件下(如综合PD-L1免疫组化和GEP+TMB综合分析)，其AUC将提高到0.74,而mIHC/IF免疫微环境综合分析方案AUC仍高于该联合方案(AUC=0.79),说明mIHC/IF多重组化检测方案对于肿瘤的诊断和免疫ZL具有Z佳的预测价值。

2、Nature

      近来关于肿瘤微环境分析与免疫ZL相关研究成果接连发表，2019年6月26日Nature发表了巴黎大学Immune evasion before tumor invasion in early lung squamous carcinogenesis的研究论文，该文利用Phenoptics组织微环境分析方案对于肺癌病人样本的肿瘤免疫细胞进行了深度的分型分析，阐述了肺鳞状细胞癌发生过程相关免疫细胞空间分布定位的差异性变化，从而揭示肿瘤免疫微环境的重塑有利于对肿瘤的jing准ZL。

3、Nature Immunology

      2019年7月8日来自美国希望之城癌症ZX的科研人员在Nature Immunology发文同样阐述了Phenoptics肿瘤微环境分析方案在乳腺癌的诊断和ZL方面具有极大的潜力和价值(Connecting blood and intratumoral Treg cell activity in predicting future relapse in breast cancer)，可以有效的对乳腺癌病人ZL后的复发风险进行预测，从而为患者的jing准诊疗提供重要的数据支持。

4、Nature Communications

      2018年度诺贝尔奖生理学或医学奖得主James Allison教授早在2017年领导的一项研究就应用Phenoptics多重免疫组化方案深度分析了胰 腺癌病例肿瘤组织微环境与临床预后信息具有极高的相关性，该研究成果发表在Nature子刊 Nature Communications (Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer)，而相关的研究方案将为肿瘤的免疫ZL提供新的诊疗依据从而更好的给肿瘤患者制定有效的ZL方案。

总结：独特的Phenoptics多光谱组织微环境景观分析方案融合了Opal多重免疫组化染色、Vectra多光谱成像和inForm智能组织定量分析技术，可以wan美实现传统肿瘤检测方案难以解决的技术难题，从而更好的实现对于肿瘤患者的jing准诊断和ZL。

网络讲座

讲座时间：

2019年8月27日12:00 PM(北京时间)

讲座题目：

Comprehensive Meta-analysis of Biomarker Technologies for Predictive Response of PD-1/PD-L1 Checkpoint Therapies

主讲人：

霍普金斯大学 Steve Lu

Akoya Biosciences Cliff Hoyt

内容简介：

详细分享Phenoptics分析方案的特点和技术优势，包括多种生物标记技术预测PD-1/PD-L1免疫ZL的预测指标分析，免疫细胞亚群定量蛋白检测的重要性以及疾病状态下细胞空间分布差异比较与应用，用于稳定且高通量临床研究的多重免疫荧光方法的Z新进展等内容。

会议地址：

https://www.labroots.com/ms/webinar/akoya-biosciences-series-comprehensive-metaanalysis-biomarker-technologies-predictive-response-pd-1

参考文献

1. Wang L, Simons D L, Lu X, et al. Connecting blood and intratumoral T reg cell activity in predicting future relapse in breast cancer[J]. Nature immunology, 2019: 1.

2. Lu S, Stein J E, Rimm D L, et al. Comparison of Biomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1 Checkpoint Blockade: A Systematic Review and Meta-analysis[J]. JAMA oncology, 2019.

3. Carstens J L, De Sampaio P C, Yang D, et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer[J]. Nature communications, 2017, 8: 15095.

4. Mascaux C, Angelova M, Vasaturo A, et al. Immune evasion before tumour invasion in early lung squamous carcinogenesis[J]. Nature, 2019: 1.

5. Soo R A, Lim J S Y, Asuncion B R, et al. Determinants of variability of five programmed death ligand-1 immunohistochemistry assays in non-small cell lung cancer samples[J]. Oncotarget, 2018, 9(6): 6841.

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

      Z近数十年以来肿瘤的免疫ZL相关研究取得了革命性的突破，特别是基于PD-1、CTLA-4等类似的免疫检查点YZ剂的ZL方案表现尤为突出。但是即便如此，肿瘤的免疫ZL领域仍然面临巨大的挑战，比如治LX果的不确定性、患者反应的不可预估性、免疫ZL耐药抵抗及检测生物标志物缺乏等都制约了对肿瘤患者的jing准有效ZL。

Balkwill F R, Capasso M, Hagemann T. The tumor microenvironment at a glance.

      当前大量的临床案例和科学研究表明肿瘤免疫微环境的深度解析将是破除肿瘤免疫ZL障碍的关键所在。肿瘤免疫微环境在肿瘤发生、侵袭、转移及ZL耐受过程中占据重要位置，细化免疫微环境的细胞免疫分型，切实有效的分子分型定量研究是指导肿瘤jing准ZL的基础，也是在jing准医学时代背景下亟需解决的难题。

      独特的PhenopticsTM多光谱组织微环境景观分析方案融合了Opal多色荧光样品标记、Vectra多光谱成像和inForm智能组织定量分析技术，可以wan美的实现传统分析方案难以解决的技术难题，从而更好的实现对于肿瘤患者的jing准诊断和ZL。

      2019年6月26日，Nature杂志在线发表了巴黎大学Jérôme Galon教授研究组题为Immune evasion before tumor invasion in early lung squamous carcinogenesis的研究论文，该文充分利用了PhenopticsTM组织微环境分析方案对于肺癌病人样本的肿瘤免疫细胞进行了深度的分型分析，阐述了肺鳞状细胞癌发生过程在侵袭前病变组织和肿瘤微环境的细胞分型改变以及相关免疫细胞空间分布定位的差异性变化，从而揭示肿瘤免疫微环境的重塑有利于对肿瘤的发SF展进行调控和jing准ZL，为提高肿瘤免疫ZL的有效率提供了新的技术思路和方法。

Nature. 2019 Jun 26. doi: 10.1038/s41586-019-1330-0

      该研究工作的ling导者Jérôme Galon教授一直致力于利用PhenopticsTM组织微环境分析方案进行肿瘤免疫ZL研究和新的免疫ZL组合策略方案开发。附图来自Jérôme Galon教授基于Opal多色荧光标记技术获取的肿瘤组织免疫微环境描绘图片，为肿瘤免疫诊断和jing准ZL提供重要的参考依据。

来源：https://www.epo.org/learning-events/european-inventor/finalists/2019/galon.html

      全新的PhenopticsTM组织微环境分析方案可以实现在组织切片样本上实现多达9色的靶点抗原荧光标记和检测，并且进行多种类型细胞的分型定量研究深度挖掘组织微环境所蕴含的生物学信息，从而为肿瘤的免疫学研究和jing准ZL提供可靠依据。

Phenoptics™  组织微环境分析方案—Opal 9色荧光标记示例图

关于珀金埃尔默：

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　　台风施虐下的科研执着!肿瘤免疫与肿瘤微环境研讨会圆满落幕

　　经过连日的精心筹备，由Bio-Techne与PerkinElmer共同主办，广州睿贝医学科技有限公司协办的肿瘤免疫与肿瘤微环境研讨会于2018年9月16日在广州花园酒店圆满结束。肿瘤免疫研究领域的专家、学者顶着chao强台风“山竹”的肆虐，齐聚一堂，共同度过这次“干货满满”的分享盛会。

　　在半天的议程中，会议聚焦肿瘤免疫研究与ZL以及肿瘤微环境研究的新思路、新方法，从RNA到蛋白多靶点深度解析肿瘤，共同探讨肿瘤免疫ZL的科研成果向临床转化的方式方法。

　　会议精彩瞬间剪影

　　Bio-Techne大中华区董事总经理裴立文先生在本次会议上，分享了Bio-Techne品牌的发展历程、在ZG的战略布局以及主营业务，并提出Bio-Techne力求推动生命科学发展到ji致的服务宗旨。

　　Bio-Techne 大中华区董事总经理裴立文先生致辞

　　PerkinElmer DAS华南区总经理林森先生回顾了近年来肿瘤免疫领域的突破性进展，并提出PerkinElmer组织原位微环境单细胞分型定量的ZL解析方案，以切实帮助学者们在肿瘤免疫领域实现研究突破。

　　PerkinElmer DAS华南区总经理林森先生致辞

　　本次会议邀请到业界4位知名大咖进行了精彩报告，深度回顾肿瘤免疫研究及ZL领域的现状、瓶颈与突破性进展，无私地分享自己的科研成果与研究思路，共觅医学转化的破晓之光。与会老师们在开放自由的氛围下，共享临床与科研资源，为接下来的合作奠定了坚实基础。

　　l 精彩报告回顾

　　主讲嘉宾

　　廉哲雄：自身免疫性肝病的免疫学发病机制

　　华南理工大学医学院、生命科学研究院副院长

　　廉老师为我们深度回顾了该实验室近些年在自身免疫性肝病的研究，并高瞻远瞩地提出科研成果向临床转化的意义，让与会的老师们受益匪浅。

　　廉哲雄教授作精彩报告

　　许大康：An integrative approach to narrow gaps to understanding of Immunosuppression in the pancreatic tumor-microenvironment

　　上海交通大学医学院检验系研究ZX主任，医学博士，博士生导师，曾任Monash大学分子与转化医学系研究室主任。

　　许老师就肿瘤微环境的解析问题进行了深入的分享与探讨，无私地向我们回顾了近年来自己的研究成果与研究思路，同时表达出对未来科研向临床转化的重视和期许。

　　许大康教授作精彩报告

　　周鹏辉：Tumor Microenvironment Impeded Cancer Immunotherapy

　　现任中山大学肿瘤FZZX，华南肿瘤学国家ZD实验室教授、博士生导师，先后入选中山大学“百人计划二期”青年杰出人才，中组部“青年千人计划”，长期从事肿瘤免疫学和肿瘤免疫ZL研究。

　　周老师向我们全面介绍了细胞ZL这一近些年的热点研究领域，及领域中的突破性进展，并结合自己正在从事的走在细胞ZL领域前沿的研究，向与会者展示出先进的科研临床转化理念与方案，令与会者获益良多。

　　周鹏辉教授作精彩报告

　　欧阳能太：RNAscope在肿瘤PD-L1表达的临床应用探讨

　　中山大学附属孙逸仙纪念医院细胞分子诊断ZX主任

　　欧阳老师结合自己强大专业的病理学临床诊断经验积累，同与会者就临床组织水平研究与诊断的方案进行深入探讨，并从临床病理诊断的角度为诠释了肿瘤微环境研究的价值和意义。

　　欧阳能太教授作精彩报告

　　本次研讨会上与会专家分享真知灼见，引起热烈的讨论与共鸣。

　　相关资料下载：

　　Vectra 系列-组织微环境景观分析

http://www.yiqi.com/technology/file_105067.html

　　PerkinElmer肿瘤免疫微环境景观分析方案

http://www.yiqi.com/technology/file_105066.html

肿瘤的发展除了与癌细胞自身基因突变导致的恶性增殖有关以外，还与肿瘤微环境息息相关。在癌症中，正常组织中和谐的细胞相互作用关系被破坏，原本保护正常细胞生存的微环境在肿瘤细胞的影响下，逐渐演变成适应肿瘤生长的条件。针对肿瘤微环境的检测和表征研究也可为癌症治 疗提供新的思路。

目前空间多组学技术已用于研究几种类型癌症中肿瘤免疫微环境的转录组、蛋白质组和代谢组，从这些方法获得的数据已与免疫组化和多参数分析相结合，以产生癌症进展的标记物。传统分析技术受样品空间分辨率以及分析灵敏度的限制，无法精 准获取靶向部位，而对其中特异代谢物的差异表征就更加困难。组织切片伴随着显微镜技术等的发展而得到广泛的应用，而激光显微切割 (LMD, laser microdissection) 技术（如使用Leica LMD6/7）可以方便地对特定的组织区域进行精确分离（图2）。结合高灵敏度的液质联用检测技术，基于SCIEX的ZenoTOF® 7600 系统，将空间定位准确的微区细胞代谢谱进行全面准确的表征。代谢谱是免疫微环境的重要调节因子，可能通过影响癌细胞的增殖潜能和适应环境而发挥作用。代谢特征的异质性似乎有助于肿瘤免疫微环境的异质性。

图1. 激光显微切割-空间多组学质谱分析流程

肿瘤微区样品制备

由制备好的肿瘤组织切片样本置于激光显微切割载物台，确定好焦距平面后，将视野移动到待切割的细胞区域（先通过H&E染色的平行样本确定肿瘤组织分区），在调节好相关参数后开始进行切割。通过对样本分别进行水溶性代谢物和脂溶性代谢物的提取，进而进行基于液质联用系统的全面的代谢组学分析。

图2. 组织切片样本用于激光显微切割分离体制备。经过苏木精-伊红（HE）染色确定组织切片中不同类型的细胞区域（左）包括原位癌、浸润癌和癌旁细胞，在平行的未染色组织切片中的相应位置进行激光显微切割获得分离体（右）。

Leica 激光显微切割系列产品利用UV激光可直接从组织切片制备分子生物分析所需的样品，可用于基因组学、转录物组学、蛋白质组学、代谢物组学和活细胞应用等的快速、精确且高质量的切割。

图3. 徕卡激光显微切割流程（通过重力作用收集感兴趣区域）

代谢物全面表征

组织细胞中代谢物成分复杂多样，且有较多同分异构体，仅有准确的高分辨一级无法对化合物进行确证。针对大量样本，SCIEX OS软件可自动进行峰提取和搜库，通过一级质量数、同位素丰度和二级碎片的匹配对样本中的代谢物进行鉴别（图3），使筛查流程快速准确。在代谢组学的样本中共鉴定173个化合物，包括氨基酸类、核苷类、吲哚类、脂肪酸类等。

图4. 代谢物鉴定界面示例。以样本中鉴定到的脯氨酸（Proline）为例，Proline分子式为C5H9NO2，检测到的MS信号与理论质荷比相比，质量数偏差为-0.3ppm，同位素丰度比与理论值偏差为1.3%，MSMS与代谢物库中Proline的标准谱图匹配度为100，以此可判定鉴定到的信号为Proline。

在脂质组学分析样本中共鉴定到550个脂质化合物，基于ZenoTOF® 7600 系统特有的电子活化解离（EAD）碎裂模式，可以鉴定出其中一些脂质化合物的精细结构，如脂肪酸链连接的具体位置（sn1或sn2）以及连接的不饱和脂肪酸双键的具体位置（图4）；对于样本中检测到的脂质化合物包括固醇酯类、神经酰胺类、溶血磷脂胆碱类、磷脂胆碱类、溶血磷脂乙醇胺类、磷脂乙醇胺类、磷脂肌醇类、磷脂丝氨酸类、鞘酯类、甘油二酯类、甘油三酯类。

图5. 脂质化合物精细结构鉴定示例。以甘油三酯TG (18:1/18:1/18:1)为例，在EAD碎裂模式下，化合物[M+Na]+峰可以产生特征的碎片离子，帮助解析甘油三个羟基各自所连接的脂肪酸组成，以及在高质荷比区域产生的连续CH2断裂碎片确定不饱和键的位置（C9和C10间为双键）。

差异代谢物分析

在质控样本（quality control, QC, 所有样本等体积混合，整个分析批次中每6个样本穿插一针QC样本进样）中，化合物峰面积RSD%不超过30%（n=8），在代谢组学样本中共检出100个代谢物，脂质组学样本中共检出502个代谢物，并将这些化合物在所有的样本包括原位癌组织、浸润癌组织、癌旁组织进行峰面积提取。

将获得的各种组织中化合物含量信息进行生物统计学分析，以浸润癌组织v.s.癌旁组织为例，共找到84个差异代谢物（图5）。经过后续进一步生物学验证，确定的差异代谢物可以帮助开展癌细胞在空间定位及异质性的精 准区分工作，更好的理解例如肿瘤转移的起源和发展、侵袭能力、对药物的敏感性等方面的特点，从而制定个体化的精 准治 疗方案。

图6. 浸润癌组织v.s.癌旁组织中的差异代谢物热图。通过统计学分析，包括t-test的p值小于0.05以及PLSDA计算的VIP值不小于1作为筛选条件，获得了84个差异代谢物。

总结

通过对组织切片进行激光显微切割获取空间定位准确的微量样本，并与SCIEX ZenoTOF® 7600 系统相结合，实现微量细胞水溶性和脂溶性代谢物的全面表征以及高灵敏度组学分析。可将此方案应用于其他组织切片样本，助力空间多组学研究的开展。

致谢：

感谢厦门大学生命科学学院林树海教授及其课题组成员华铮翼、姚博对方案中组织切片和样本制备的支持；

感谢丹纳赫生命科学平台徕卡显微系统公司高天龙、连其林对显微切割技术的支持。

空间多组学研究LMD平台：

徕卡激光显微切割系统

Leica LMD7

激光显微切割（LMD）是一种适用于精确制备样品的技术。在许多研究领域，它是获得纯净的、单一的后续实验起始材料的先决条件。在基因组学、转录组学、微阵列、二代测序、生物芯片和蛋白质组学等领域中，需要使用这项高精度技术以进行有意义的分析。Leica LMD系列用UV激光直接从组织切片制备分子生物分析所需的样品。随着创新方法和仪器的不断开发，激光显微切割在其他领域的应用也日益广泛，如活细胞研究、气候研究和电子显微镜的玻片雕刻。现在，研究人员正在以前所未有的水平使用LMD来最 大化影响他们的研究。

徕卡显微系统为用户提供了一种精确、高度选择性的激光显微切割方法，可用于如下各种应用：

快速、精确地分离超纯细胞和细胞群；

用于基因组学、转录物组学、蛋白质组学、代谢物组学和活细胞应用的高质量切割；

方便地使用激光制备活细胞和其他样品；

标记和可追溯显微镜下的样品。

空间多组学研究质谱平台：

多重碎裂高分辨质谱

SCIEX ZenoTOF® 7600 系统

ZenoTOF® 7600 系统于2021年推出即获得国际“分析科学家创新奖”之首，集成了多项前沿新技术，包括：

能实现更高二级质谱灵敏度的Zeno™ Trap (Zeno 阱) 技术；

能与经典CID碎裂技术互补的电子活化解离 (EAD) 技术；

升级的133Hz超快速二级质谱扫描能力；

新一代全景质谱Zeno SWATH® DIA数据依赖型采集技术等。

多重碎裂质谱ZenoTOF® 7600 系统的卓 越性能，大大提升生命科学多组学研究的深度和广度，尤其在高通量高深度蛋白质组学、蛋白质翻译后修饰（尤其是糖蛋白质组学）、全景非靶向代谢组学、脂质精细结构解析等尖 端领域获得广泛应用。

6月28日，Cell Signaling Technology（CST）特邀徕卡显微系统产品经理童昕做客博士云讲座，带大家了解免疫荧光显微成像技术如何助力肿瘤微环境研究。欢迎注册报名，在线学习交流，更有机会赢取精美礼品！

博士云讲座

讲座时间

2023-06-28 13:00-14:00

讲座主题

免疫荧光显微成像技术助力肿瘤微环境研究

讲座简介

免疫荧光显微成像的发展已有数十年之久，在传统细胞生物学领域帮助科学家们探索了许多未知的洞见。近年来，在肿瘤免疫领域兴起的多组学技术，免疫荧光显微成像的方法在保证组织原位性的前提之下，获取了大量肿瘤微环境的空间信息，极大地丰富了科学家们对于肿瘤微环境的认识。

主讲人

童昕    产品经理

徕卡显微系统

童昕毕业于中山大学医学院，2019年进入显微成像行业，在显微成像系统的硬件、软件及应用方面积累了丰富的经验。目前就职于徕卡显微系统，担任产品经理，负责宽场系统的全国产品推广工作。

主持人

朱传镇    博士

CST中国售前科学家

朱传镇博士毕业于中国科学院脑科学与智能卓 越创新中心，研究课题主要为RNA结合蛋白、microRNA等对生物节律的转录后调控，对抗体应用等相关实验技术有丰富的实战经验。加入CST之前，朱博士同样在抗体行业从事科学信息沟通及培训相关工作，目前任CST中国售前科学家，负责CST大中华区售前技术支持工作。

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4月20日上午，徕卡与转化医学网共同举办了网络研讨会——“抽丝剥茧，超多重免疫标记解密肿瘤微环境之奥秘”。徕卡生命科学部的高级应用专员刘继红和Cell DIVE应用科学家Michael Smith为广大观众揭示了CELL DIVE 超多重标记解决方案如何轻松应对复杂的肿瘤微环境，为临床肿瘤的研究和治 疗提供了优秀的研究工具。Indica Labs应用科学家赵永田重 点介绍了在HALO中对获取的Cell DIVE图像的处理、分析步骤以及如何进行高纬的空间生物学分析，用以了解肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞的相互作用关系对研究肿瘤免疫应答的作用机制。

01

CELL DIVE使用的抗体是开放的吗？有大约多少种经过验证的抗体？

A：CELL DIVE 的抗体是开放的，有350种以上的抗体经过验证的抗体可以使用。

02

CELL DIVE可以在临床上用吗，是否有注册证？

A：目前没有注册证，正在申请中。

03

这个平台的检测联系哪位呢？

A：可以联系Leica公司各地的应用支持和销售。

04

这个染色是仪器自动染色吗？

A：可以手动染色也可以和自动染色仪联用自动染色。

05

哪个实验室可以检测？

A：Leica公司有DEMO机，可以提供一定的演示。

06

成像是全片还是一个视野？

A：成像仪可以选择全片成像或者选取一个或多个视野成像。

07

怎样避免非特异性染色 ？核阳性的和胞浆包膜可以随意搭配吗？

A：首先要选择特异性好的抗体，我们抗体库的抗体都是经过验证的抗体。

细胞核阳性和胞浆包膜理论上可以自由搭配。

08

每一轮染完了，除了染料失活，是不是还需要去除一抗？

A：每一轮染色成像完成，染料失活 不需要去除一抗。

09

CELL DIVE是不需要摸索一抗浓度的吗，固定的protocol会不会造成有的组织染不出来有的组织却染色过强？

A：徕卡的protocol适用于绝大多数的组织，有些组织的某个marker 表达特别高或者特别低，可能需要修改抗体浓度。

10

抗体是什么方法学检测标记？除了主讲人介绍的荧光滤镜，能否使用其他的荧光标记和滤镜？

A：抗体验证时参照同样marker的免疫组化的结果；为了减少串色的发生，我们推荐使用Cy2、Cy3、Cy5、Cy7光谱基本相同的染料标记。

11

成像也是设备自动化进行的吗？

A：成像时设备自动进行的，但是可以在拍照前根据样本的染色情况进行优化。

12

Did you find any nonspecific staining while utilizing the different CD markers for immune cells?（Michael Smith）

A：The Cell DIVE solution comes with a list of 350+ antibodies that have been validated for use with the workflow, and for specificity and sensitivity. For antibodies that are not used from the list, we provide details on a three part antibody validation process that also ensures that antibodies used are specific. In the case of residual nonspecific signal, this is likely removed by the autoflourescence imaging and removal of that signal that occurs at every round. So, in our hands, nonspecific staining is minimized at the level of antibody quality control and the image processing that the software performs.

13

关于细胞间邻近距离的分析，我们如何设定所计算的距离范围？

A：关于细胞间邻近距离的分析，所定义距离的范围目前还没有相应的标准。考虑到不同细胞亚型的相互作用，不同免疫细胞亚群之间邻近距离的设定可能需要不同的标准。在分析中，HALO可以对距离进行设定，并按照不同的区间（例如0~5μm，5~10μm，10~15μm……）给出邻近细胞的数量和密度。分析中先进行预分析，根据不同距离范围内免疫细胞的密度和临床信息进行相关性分析。再把确定的距离应用到所用的样本切片中。

14

在分析过程中，我们可以选择局部视野进行分析吗？还是仅能对全组织切片进行分析？

A：分析中，我们建议针对全景组织切片进行分析，但HALO也可以定义ROI区域进行选择性的视野进行分析。这两种分析方法在HALO里都可以实现的。

AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

为了研究肿瘤微环境影响下肿瘤细胞的运动性和侵袭特性，建立了体外2D侵袭方案。这种2D侵袭方案是一种共培养试验，在这种情况下，是由肿瘤和基质细胞（例如成纤维细胞）组成的。一旦两种细胞类型接触，在不同的条件下评估侵袭成纤维细胞单层的肿瘤细胞的数量，在我们的研究中，我们在模拟实体肿瘤微环境中发现的条件，例如与基质细胞（成纤维细胞）的相互作用以及成纤维细胞释放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我们使用A375黑色素瘤细胞系和真pi成纤维细胞进行了此测定。黑色素瘤细胞激活成纤维细胞，继而维持肿瘤细胞的生长，恶性转化和耐药性（Flach等，2011）。然而，在刺激所测试的抗ai化合物后，我们发现与成纤维细胞直接接触的黑素瘤细胞显示出运动能力受损并且未能侵袭成纤维细胞层。

材料和试剂

1. GFP-A375细胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纤维细胞（从健康患者中分离）

3. MEF细胞培养基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最终浓度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm浓度下使用，用DMSO稀释

仪器设备

1. 层流净化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 台式离心机

4. 细胞计数器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/预置2孔插件培养皿（ibidi:81176）

6.细胞培养管

7. 涡旋

8. 镊子

9. 光学显微镜

10. 荧光显微镜

11. NIS-Elements软件

ibidi:81176

实验流程

01. 将GFP-A375和番茄成纤维细胞系稳定地保存在MEF培养基中，在37°C和5%C02加湿培养箱中。

02. 当细胞达到亚融合度（约80％融合度）时，在带有PBS的通风橱中清洗它们，以去除死细胞和碎片。

03. 在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化细胞约5分钟，然后添加MEF培养基以阻止反应。

04. 将细胞悬浮液收集在15ml细胞培养管中，并用台式离心机（1500xg,5´,RT）短暂离心。

05. 将细胞重新悬浮在新鲜培养基中；将一体积的细胞悬液与另一体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数器计数活细胞。

06. 在MEF缓冲液中以4x105细胞/ml的浓度稀释细胞。

07. 在多孔板上，在每个孔的中间放置一个Culture-Insert2孔（2孔培养插件）。

08. 用75µl（3x104细胞）FP-A375细胞填充插入物一侧，并用番茄成纤维细胞填充另一侧。用移液器上下混合插入物中的细胞，以确保细胞完全分布。

09. 将多孔板放在培养箱中，放置过夜。

10. 第二天，在镊子的帮助下，小心地从每孔中取出培养基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鲜的MEF培养基。

12. 用光学显微镜检查GPF-A375与Tomto成纤维细胞之间产生的间隙的闭合状态。

13. 一旦每个孔中的间隙完全闭合，请使用荧光显微镜和成像软件获取荧光图像。确保肿瘤细胞尚未侵入成纤维细胞单层。

14. 小心地除去培养基，并在控制组孔中添加培养基+0.1％PBS，在处理组孔中添加培养基+300nM丝裂霉素A。将板放在培养箱中24小时（处理孵育时间）。

24小时后，在荧光显微镜下重新采集共培养孔，以评估治疗组与对照组（绿色荧光细胞散布在红色标记层上）的肿瘤细胞侵袭行为的任何变化（图2）。

图1：2D侵袭系统的示意图

图2：2D侵袭检测的荧光图像

将黑素瘤细胞和成纤维细胞共培养，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小时后，评估侵袭成纤维细胞层的肿瘤细胞的数目。A375细胞显示出大规模的侵袭行为，受到MithramycinA治疗的损害。比例尺：500μm。

备注：

1.此处描述了MEF培养基组成（参考文献1）。

2.此文仅供参考。

3.此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者。

参考文献：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

 概述

基于 T 细胞的疗法正在迅速发展成为许多癌症的有效一线ZL选择。近年来， FDA 已经批准了几种针对免疫检查点的ZL性抗体和小分子用于临床，以补充和提高T 细胞的靶向性和有效性。这些免疫检查点YZ剂的临床前筛选需要强大的体外肿瘤模型来评估 T 细胞杀伤效率。但是，传统的 2D 肿瘤模型通常缺乏生物学相关性和复杂性来预测体内或临床结果。 3D 生物打印平台以及许多其他 3D 培养方法，提供了在生理上更相关的组织模型中自动筛选各种分子和药物的潜力。在此，在此概念验证研究中，我们描述了小鼠肺癌的同系生物打印肿瘤模型，以在细胞细胞毒性测定中评估免疫检查点YZ剂（PD-1）。在生物印记的肿瘤中观察到 T 细胞浓度依赖性杀伤， 并且添加免疫检查点抗体进一步增强了 T 细胞杀伤效力。有人建议，生物打印的 T 细胞细胞毒性测定法可能使研究人员能够在更有效的转化模型中筛选检查点YZ剂。

引言

       T 淋巴细胞（T 细胞）在实现对传染病和癌症的长期免疫中起着至关重要的作用。 T 细胞可以在感染或癌细胞表面上的主要组织相容性复合物（MHC）分子的背景下识别特定抗原。这种特异性识别导致 T 细胞分泌有毒颗粒，从而特异性杀死靶细胞。传统上，已经使用在二维（2D）单层中生长的靶细胞进行了 T 细胞杀伤（细胞毒性）测定（Golstein，2018）。这些 2D 分析可通过成像或其他方式快速轻松地进行终点分析。但是，在人体内部，T 细胞介导的靶细胞杀伤发生在三维（3D）环境中，这归因于 T 细胞迁移或渗入 3D 组织核心的其他障碍。因此，3D T 细胞细胞毒性测定法在生理上更相关，并被认为可以更好地预测体内实验的结果。在免疫刺激剂的临床试验中，使用三维肿瘤模型进行细胞毒性试验越来越受到关注。

检查点阻断疗法的ZX发展彻底改变了癌症ZL领域，通过YZ免疫检查点来增强 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤（Topalian，2016）。几种检查点YZ剂，例如抗PD1 和抗 PD-L1 抗体，已被批准用于临床（Sharon，2014 年）。然而，开发高通量 T 细胞毒性测定法以快速和低成本地筛选此类YZ剂的需求仍然没有得到满足。

      已经研究了几种 3D 肿瘤模型，包括球状体、悬滴和微流控芯片模型，用于 T 细胞细胞毒性测定。 例如，胶原蛋白-纤维蛋白凝胶用于在 3D 环境中生长癌细胞，以确定杀死所有癌细胞所需的 T 细胞的JD浓度（Budhu，2010）。最近，微流体球体培养用于免疫检查点封锁的体外分析（Jenkins，2018）。 尽管这些模型在模仿体内环境的某些方面显示出希望，但它们通常通量低或无法考虑细胞外基质（ECM）在肿瘤生物学中的关键作用。

      生物打印是一项新兴技术，使研究人员能够自动化制造肿瘤构建体以筛选抗ai药或免疫刺激剂。该技术沉积了一种充满细胞的 ECM 材料（通常称为生物墨水），与肿瘤细胞混合，随后进行化学或热固化，从而为打印结构提供机械强度。在这里，我们探索了3D T 细胞细胞毒性测定法的生物打印技术的潜力，以帮助评估免疫检查点YZ剂。

材料和方法

细胞准备

为该项目选择了小鼠肺癌细胞系（LLC-1）和同型 OT-1T 细胞。两种细胞类型均在C57BL/6 背景中。 Lewis 肺癌细胞（LLC-1）从美国典型培养物保藏ZX（ATCC）获得，并根据建议的方案进行培养，每 3 至 4 天传代一次。 为了促进活肿瘤细胞的成像，将编码红色荧光蛋白（RFP）的质粒引入 LLC-1 细胞，以生成稳定的 LLC-RFP 细胞。LLC-RFP 细胞（此后称为“LLC-1”）用于其余实验。按照先前发布的方案（Nath，2016 年），使用 0.75µg / mL SIINFEKL（Ova）肽（New England Peptide）培养 OT-1 脾细胞并将其灌注 5 天。 在第 5 天的共培养研究中，未经进一步纯化就使用了引发的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）。

生物墨水的制备和生物打印

中和胶原蛋白 I（CELLINK），并与每毫升胶原蛋白中的 106LLC-1 细胞混合。将所有组件（包括注射器，针头和针尖）置于冰上，直至准备使用。将温度控制的打印头（TCPH）设置为 8°C，而将打印床设置为 10°C。使用 BIO X（软件版本 1.8）上的液滴功能在 96 孔板（n= 3）中对三维 LLC-1 肿瘤进行生物打印（见图 1）。印刷后，将 96 孔板转移到 37°C 的恒温培养箱中 20 分钟，以使胶原蛋白聚合。接下来，将 200 µL DMEM 培养基添加到每个孔中。 媒体每 3 天刷新一次。 肿瘤生长 5 天，然后与 T 细胞共培养。

图 1. 肿瘤的三维（3D）生物打印。 使用 BIO X 的液滴打印功能，用胶原蛋白对 Lewis 肺癌细胞（LLC-1）进行胶原蛋白印刷。将胶原蛋白液滴（肿瘤）热固化并在 DMEM 培养基中保持 5 天，然后再与 T 细胞共培养。

 在第 4 天，将打印的肿瘤与 1 µg/ mL 的 SIINFEKL 肽孵育 24 小时，以使肿瘤细胞表达相关抗原。 在第 5 天， 洗涤打印的肿瘤， 并以不同的效应子与靶标（ E∶T） 比

（0∶5）与 T 细胞共培养 48 小时。对于阳性对照，将肿瘤与依托泊苷或 TNFα孵育以诱导细胞凋亡引起的细胞死亡。 阴性对照孔未接受任何 T 细胞或凋亡诱导剂。对于抗原特异性，少数（n = 8）孔中的肿瘤未用 SIINFEKL ZL，但接受了引发的 T 细胞。为了进行免疫检查点分析， 将引发的 T 细胞用 1μg/mL 的抗 PD-1 抗体（ 克隆RMP1-14，InVivoMab）预处理 1 小时，然后将其加入与肿瘤的共培养物中（n = 8）。保留 IgG 同种型对照用于比较。

影像和统计

如先前所述（Steff，2001；Strebel，2001），RFP 荧光的损失被用作肿瘤细胞死亡的读数。 使用 EVOS Auto 2 荧光显微镜进行成像。 使用 ImageJ 软件（NIH）测量荧光强度，并使用 Graphpad Prism 8 进行图形翻译和制备。通过使用学生的 t 检验在 Prism 中对统计结果进行统计，数据表示为平均值±SEM。

结果与讨论

肿瘤细胞生长和球状体形成

      BIO X 上的液滴功能能够自动将稳定的胶原蛋白肿瘤液滴分配到 96 孔板中。 液滴形状和孔位置的均匀性有助于整个显微镜和分析工作流程。 对打印的肿瘤进行 RFP 荧光成像，并用 Calcein AM 染色以确定细胞活力。 图 2 中显示的结果表明，LLC-1 细胞在第5 天在打印的肿瘤中是可行的。此外，这些细胞被限制在胶原蛋白内，而不是逃逸其结构以在 2D 表面上生长。

图 2. 肿瘤细胞的生长和生存力。 对打印的肿瘤进行 RFP 荧光成像，并用钙黄绿素 AM 染色以确定 T 细胞筛选前第 5 天的细胞活力。

3D 中的 T 细胞细胞毒性测定

T 细胞介导的细胞毒性被定量和定性验证。 当将肿瘤与 T 细胞共培养时，观察到肿瘤细胞活力的 T 细胞浓度依赖性降低（见图 3A）。 在 5：1（E：T）的比率（代表 106 CTL/孔）下，与无 CTL 对照相比，观察到了肿瘤生存力的统计学显着降低（p=0.0003）（〜30％）。 在存在或不存在 T 细胞的情况下，打印肿瘤的代表性图像显示在图 3B中，当在共培养物中存在 T 细胞时，RFP 荧光显示出质的下降。T 细胞能够附着在胶原屏障上并在 3D ECM 环境中与癌细胞相互作用。

图 3. 在第 5 天使用 3D 生物打印的肿瘤模型进行 T 细胞细胞毒性测定。（A）观察到 T 细胞浓度依赖性地降低了肿瘤细胞的活力，这是通过 RFP 荧光的丧失来确定的。 CTL 的数量代表每孔的总 CTL。 （B）显示了在存在或不存在 T 细胞的情况下打印的肿瘤的代表性图像。 使用相同的采集参数拍摄图像。

免疫检查点测定

为了扩大 T 细胞杀伤的效用或限制，将肿瘤与经抗 PD1 抗体预处理的初免 T 细胞以 5：1 的 E：T 比例共培养。如图 4 所示，与同种型对照相比，使用抗 PD1 抗体阻断 PD-1 / PD-L1 轴显示出 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤的增加（p＝0.0039）。 因此，由于 PD-1 检查点的阻滞，引发的 T 细胞能够更有效地附着在胶原蛋白屏障上， 更有效地浸润和杀死肿瘤细胞。

图 4. 免疫检查 （A）显示了免疫检查点阻断测定的示意图。 单克隆抗 PD1 抗体阻断了 PD1 与 PD-L1 之间的相互作用，从而增强了 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤力。（B）在 IgG 同种型对照或抗 PD1 抗体存在下，将 3D 生物打印的肿瘤细胞与初免化的 T 细胞以 5：1 的 E：T 比例共培养。 PD1 阻断显示出对靶细胞的增强杀伤作用。

结论

v 3D 生物打印技术可用于 T 细胞细胞毒性测定中，以用胶原蛋白打印 RFP 标记的鼠类肺癌细胞。

v 生物打印的肿瘤细胞在胶原蛋白基质内仍然被限制和存活。 观察到 T 细胞浓度依赖性的细胞毒性增加。

v 如文献所述，抗 PD-1 抗体的使用增强了 T 细胞介导的杀伤效率。

v T 细胞细胞毒性测定与高含量成像工作流程兼容，还可以适应其他肿瘤模型，包括患者来源的异种移植，以加快药物筛选过程并推动个性化药物的临床转化。

v 进一步的研究可能包括通过生物打印的肿瘤细胞对抗原呈递的定量，肿瘤中 T 细胞的浸润以及 T 细胞表达的细胞因子。

v 此外，BIO X 上的多孔生物打印格式可用于扩大对生物试剂（例如免疫检查点YZ剂）和工程 T 细胞（CAR-T）的高通量筛选的支持。

参考文献

1. Budhu, S., Loike, J. D., Pandolfi, A. CD8+ T cell concentration determines their efficiency in killing cognate antigen-expressing syngeneic mammalian cells in vitro and in mouse tissues. Journal of Experimental Medicine. 2010; 207(1): 223–235. DOI: 10.1084/jem.20091279.

2. Golstein, P. and Griffiths, G. M. An early history of T cell-mediated cytotoxicity. Nature Reviews Immunology. 2018; 18(8): 527–535. DOI: 10.1038/s41577-018-0009-3.

3. Jenkins, R. W., Aref, A. R., Lizotte, P. H., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. 2018; 8(2): 196–215. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-17-0833.

4. Nath, S., Christian, L., Tan, S. Y., et al. Dynein seperately partners with NDE1 and dynactin to orchestrate T cell focused secretion. Journal of Immunology. 2016; 197(6): 2090–2101. DOI:10.4049/jimmunol.1600180.

5. Sharon, E., Streicher, H., Goncalves, P., and Chen, H. X. Immune checkpoint inhibitors in clinical trials. Chinese Journal of Cancer. 2014; 33(9): 434–444. DOI: 10.5732/cjc.014.10122.

6. Steff, A.-M., Fortin, M., Arguin, C., and Hugo, P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001; 45(4): 237–243. DOI: 10.1002/1097-0320(20011201)45:4<237::AIDCYTO10024>3.0.CO;2-J.

7. Strebel, A., Harr, T., Bachmann, F., et al. Green fluorescent protein as a novel tool to measure apoptosis and necrosis. Cytometry. 2001; 43(2): 126–133. DOI: 10.1002/1097-0320(20010201)43:2<126::AID

CYTO1027>3.0.CO;2-J.

8. Topalian, S., Taube, J., Anders, R. et al. Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 2016; 16(5): 275–287. DOI: 10.1038/nrc.2016.36.

癌症仍然是威胁人类健康Zda的敌人之一，虽然目前针对癌症的ZL方案有了很大的发展，但是癌症治愈难并且ZL费用高的现状仍然不会在短时间内得到改善。因此，除了在ZL阶段应对癌症外，早期的诊断检出仍然是降低肿瘤死亡率的重要手段。

除常规筛查外，内源性肿瘤标志物的检测成为当前发展的新兴技术，其中包括CTC，ctDNA以及肿瘤外泌体等的检测。内源性标志物检测的难点在于体内标志物会快速清除且检测背景高以及体内无法富集都是导致它们应用难以推广的重要原因。

为解决这个难题，美国斯坦福大学医学院的San极v Gambhir博士团队对免疫细胞中的巨噬细胞进行改造，成功在小鼠肿瘤模型中实现肿瘤细胞的早期检测和跟踪标记。

其主要策略是：通过对巨噬细胞进行改造，在肿瘤诱导产生的M2型巨噬细胞的启动子后面标记上生物发光的标记。当在肿瘤环境中，可以更加诱导巨噬细胞向M2型分化，并启动荧光素酶基因的表达。利用该策略可以检测出转移瘤以及皮下瘤的发生。

目前，这项技术可用于检测直径小至4毫米大小的肿瘤，不仅更加优于常规肿瘤体积检测，而且与常见生物标志物检测相比，如体外RLU方案，CEA指标检测方案 ，ctDNA，qtPCR方案等检测，表现出更高的灵敏度。

参考文献

San极v S. Gambhir et al. Engineered immune cells as highly sensitive cancer diagnostics. Nature Biotechnology (2019).

      2018年以来，肿瘤免疫研究进一步突破。本文将围绕陈列平教授的三篇ding级论文，揭示新一代肿瘤免疫疗法。

1、免疫正常化

      2018年10月，陈列平教授团队在《Cell》杂志上发表了A Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization关于“免疫正常化”的综述文章，肿瘤免疫正常化（Normalizing tumor immunity），在理念上改变了我们对肿瘤免疫的认识，文章指出抗PDZL（这里包括所有目标在于阻断这个通路的所有方法），在原理上并不是增强免疫反应，而是把病人自身应该有的，但在肿瘤生长中被弱化的反应带回到常态。

      文章中将免疫反应过程比作一条有流水的通道。在这个过程中，正常的免疫反应就是通道中正常通畅的水流。如果通道堵塞，水流受到影响，通道将无法充分排水。在这种情况下，“增强”策略可以解释为增加通道的压力，以克服排水不足，但如果通道内压力增加太多，就会有破坏通道的风险。反之，“正常化”策略则会通过识别并解除阻塞以恢复正常水流，避免危及通道管壁。

图1  免疫增强与免疫正常化

2、LAG-3-FGL1通路的作用

      同年12月，陈列平教授团队再次在《Cell》上发表了题为Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3的论文，证明了纤维介素蛋白1(Fibrinogen-like protein 1, FGL1)是LAG-3的一个重要的功能性配体，并揭示了该LAG-3-FGL1通路在肿瘤免疫中的作用。

      淋巴细胞活化基因3 (LAG-3)是一种主要存在于活化T细胞上的转基因膜蛋白，其主要作用是作为一种表达YZ信号的受体。纤维蛋白原样蛋白1 (FGL1)是一种肝脏分泌的蛋白质，可以YZ抗原特异性T细胞活化。

图2  FGL1作为LAG-3的功能性配体可以YZT细胞活化

      FGL1-LAG-3相互作用是独立于B7-H1-PD-1通路的另一条肿瘤免疫逃逸通路，阻断这条通路能和抗PD-1ZL起到协同作用。

      总之，本研究发现并证明了FGL1-LAG-3是肿瘤免疫逃逸的一条新通路，且可作为肿瘤免疫ZL的潜在靶点。

3、肿瘤ZL的靶点

      2019年3月，陈列平教授团队在Nature Medicine上发表题为Siglec-15 as an immune suppressor and potential target for normalization cancer immunotherapy的论文，鉴定并证明了Siglec-15是一种免疫YZ分子，可作为正常化免疫ZL的潜在靶点。

图3  TCAA筛选结果示意图

      Siglec-15是一个唾液酸结合型免疫球蛋白样凝集素家族基因，编码一个非常短的胞外结构域，该结构域包含一个免疫球蛋白可变区和一个2型恒定区。 

      该团队通过一个高通量功能筛选系统（Genome-scale T cell activity array, TCAA）鉴定了该分子。Siglec-15除了在健康的骨 髓细胞中表达外，在多种人类肿瘤细胞和肿瘤侵犯的骨 髓细胞中广泛高表达，且其表达是与B7-H1互斥的。

      Siglec-15在多种正常的免疫细胞中不表达或低表达，但在巨噬细胞中可见表达，且能被巨噬细胞集落刺激因子所诱导，是一种巨噬细胞相关的免疫YZ分子，同时Siglec-15又能为IFN-γ所调节，这可能是它与B7-H1表达互相排斥的部分原因。重要的是Siglec-15能在体内外YZ抗原特异性T细胞的活性。

      动物实验发现，基因敲除或抗体封闭Siglec-15后的转基因小鼠模型所荷载的移植瘤生长明显受YZ，肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应明显增强。Siglec-15特异性的单抗α-S15单独使用即有抗肿瘤作用，当与anti-PD-L1联合时效果明显增加。Anti-Siglec-15与已有的ZL手段相比，具有一些明显的优势，比如Siglec-15在正常组织上表达极少，正常组织可能不会受到Anti-Siglec-15疗法的影响，安全性预期良好。同时肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞可见表达，具有较高的选择性，甚至可能成为肿瘤微环境选择性ZL的靶点。

写在结尾的话：

      在陈列平教授团队的两篇研究论文中,均使用到PerkinElmer的放射性试剂和检测仪器对T细胞的功能进行研究, PerkinElmer为人类健康贡献自己的力量。如果您对我们的解决方案感兴趣可以留言给我们。

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细胞因子是肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）中细胞通讯的关键介质，在癌症的发生、发展、治 疗和预后等多个方面发挥重要作用。在过去的 40 年中，细胞因子和细胞因子受体作为癌症靶点或癌症治 疗方法得到了广泛的研究。目前公认的临床前治 疗策略为增强干扰素和白细胞介素（包括 IL-2 ，IL-7 ，IL-12 和 IL-15 ）的生长抑 制和免疫刺激作用，或抑 制细胞因子（如 TNF ，IL-1β 和 IL-6 ）的炎症和促进肿瘤的作用[1]。

图 1 . 细胞因子在肿瘤微环境中的作用

特定细胞因子的表达也与肿瘤细胞的高存活率和高转移性密切相关。其中促炎细胞因子 IL-6 和 IL-8 与多种癌症相关，包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌等 [2,3]。因此，分析细胞因子的表达是一种重要的诊断工具和预测癌症预后的关键因素。

非放射性的 RNA 原位杂交技术（ViewRNA ISH）是一种高灵敏度的检测细胞因子表达的有效方法，并且可以对 1 至 4 个 mRNA 目标进行多重分析。

检测原理如下图所示：

图 2 .  ViewRNA ISH 检测原理

安捷伦BioTek Cytation 5 多功能细胞成像微孔板检测系统，可容纳多达四个荧光通道同时成像，快速并出色地成多色荧光成像。仪器配备的高内涵分析软件可自动计算细胞内 RNA 的表达水平。Cytation 5 活细胞成像工作站结合ViewRNA ISH，为细胞因子研究提供了一种高效率、高灵敏度和可重复的检测方法。

实验案例分享

 实验一．细胞因子mRNA的成像和分析 

为研究细胞因子mRNA 在不同营养条件下的表达情况，设置两组对照实验。阳性对照细胞培养于完全培养基中，而阴性对照细胞经过 18 小时的血清饥饿处理。随后加入 ViewRNA 探针以标记 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ，在Cytation 5 上分别使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道对探针进行成像完成 ISH 细胞分析。图像结果表明：细胞因子mRNA 的表达在营养匮乏的条件下会显著降低。

图 3 . 阳性和阴性对照组成像。HCT116 放大 20 倍图像作为（ A ）阳性对照和（ B ）阴性对照。MDA-MB-231 细胞放大 40 倍的图像作为（ C ）阳性对照和（ D ）阴性对照。蓝色：DAPI 染色的细胞核；绿色：标记 IL-8 mRNA ；橙色：标记 IL-6 mRNA ；红色：标记 ACTB mRNA 。

接下来为了定量分析细胞因子表达，首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下进行细胞核计数，以确定每孔的细胞数量（图 4A ）。然后分别在GFP 、RFP 通道进行细胞因子探针（ IL-6 或 IL-8 ）的荧光信号分析（图 4B ）。通过细胞荧光信号的比率评估不同实验条件下的细胞因子表达（图 5 ）。

图 4 . 每个细胞的荧光信号分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 软件进行细胞分析圈选出 DAPI 标记的细胞核；( B ) 荧光标记的 IL-8 信号的图像分析。

如图 5 所示，使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 这一组合准确的量化了细胞内 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。

图 5 . MDA-MB-231 细胞中 IL-8 表达和 HCT116 细胞中 IL-6 表达，并以细胞数目进行校正。

 实验二．诱导细胞因子 mRNA 的表达 

使用不同剂量的 IL-1β 刺激 DU145 细胞，以分析细胞因子的 mRNA 的表达（图6）。图 7 结果显示：虽然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表达增加，但 IL-8 的表达变化更为显著，这与先前研究结果一致[4]。IL-1β 的最 高剂量下，这两种细胞因子的表达减少则是由于细胞毒性。这验证了该检测方法的可行性与稳定性。

图 6 . 不同浓度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 荧光 mRNA 探针信号 ( A ) 0 ng/mL；( B ) 0.02 ng/mL ；0.128 ng/mL；( D ) 0.8 ng/mL。蓝色：DAPI染色的细胞核；绿色：标记的IL-8 mRNA；橙色：标记的 IL-6 mRNA ；红色：标记的 ACTB mRNA 。

图 7 . 不同浓度的 IL-1β 刺激下 DU145 细胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。

 实验三．抑 制细胞因子 mRNA 的表达 

研究表明丝裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）可调节 IL-8 ，并证明用 MAPK/ERK 抑 制剂 U 0126 治 疗可减少 DU145 和 MDA-MB-231 细胞中的炎症细胞因子[4,5]。为了确认这一现象并验证 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 这一组合的能力，将不同浓度的 U 0126 加入到每种细胞类型中孵育 30 分钟。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 细胞达 3 小时，而 MDA-MB-231 细胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道进行细胞计数和图像分析以评估在 U 0126 治 疗后 IL-8 和 IL-6 细胞因子 mRNA 的表达。采集的图像（图 8 ）和计算的荧光信号强度 （图 9 ）证实了 U 0126 的抑 制作用。此外，也验证了该方法的灵敏度，可以准确识别给予抑 制剂后 mRNA 的表达变化。

图 8. U 0126 抑 制 IL-8 mRNA 的表达。图像显示了在不同浓度的 U 0126 处理后 ( A-E ) MDA-MB-231 细胞内 IL-6 、IL-8 和 ACTB 荧光 mRNA 探针信号；( F-J ) 为 DU145 细胞。蓝色：DAPI 染色的细胞核；绿色：标记的 IL-8 mRNA ；橙色：标记的 IL-6 mRNA ；红色：标记的 ACTB mRNA 。

图 9 . U 0126 治疗后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 细胞中的表达

结 语

ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 细胞分析试剂盒和探针提供一种灵敏的方法来检测 mRNA 表达。该方法在安捷伦BioTek Cytation 5 细胞成像系统的加持下得以更更快地采集多荧光通道的图像，并更精 准的计算出每一个细胞的荧光信号强度。这种检测、成像和分析的完 美结合提供了一种灵敏、灵活和高通量的方法用以检测细胞因子 mRNA 的表达。

参考文献：

[1] Propper DJ, Balkwill FR. Harnessing cytokines and chemokines for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Apr;19(4):237-253.

[2] Kampan NC, Xiang SD, McNally OM, Stephens AN, Quinn MA, Plebanski M. Immunotherapeutic Interleukin-6 or Interleukin-6 Receptor Blockade in Cancer: Challenges and Opportunities. Curr Med Chem. 2018;25(36):4785-4806.

[3] Vecchi L, Mota STS, Zóia MAP, Martins IC, de Souza JB, Santos TG, Beserra AO, de Andrade VP, Goulart LR, Araújo TG. Interleukin-6 Signaling in Triple Negative Breast Cancer Cells Elicits the Annexin A1/Formyl Peptide Receptor 1 Axis and Affects the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 May 20;11(10):1705.

[4] Kooijman R, Himpe E, Potikanond S, Coppens A. Regulation of interleukin-8 expression in human prostate cancer cells by insulin-like growth factor-I and inflammatory cytokines. Growth Horm IGF Res. 2007 Oct;17(5):383-91.

[5] Chelouche-Lev D, Miller CP, Tellez C, Ruiz M, Bar-Eli M, Price JE. Different signalling pathways regulate VEGF and IL-8 expression in breast cancer: implications for therapy. Eur J Cancer. 2004 Nov;40(16):2509-18. 

免疫层析技术在临床医学检测、激素检测、食品毒品农药检测、抗原抗体检测、动物疾病诊断等领域有着广泛的应用。提高检测灵敏度、定量检测以及多元检测是免疫层析技术发展的三个方向。尤其是检测灵敏度不高是限制免疫层析诊断技术发展的Z主要技术障碍。基于彩色微球的免疫层析技术在灵敏度方面有了较大提高，稳定性也更好。

彩色微球层析技术特点：

1、灵敏度更高，胶体金的理想替代品；
2、内部染色工艺，色彩饱满牢固，无染料表面，便于偶联；
3、亲水表面且基团含量丰富，使得蛋白结合能力更高；
4、可实现规模化供应且性能稳定，可实现单批次Z高 100L 产量；
5、微球粒径均一，常规粒径可实现 C.V. 小于 5%；
6、可定制化生产，粒径大小 (100nm～10um)、表面基团含量及
     彩虹系列色彩可调整

为什么彩色微球是胶体金的理想替代品？

疫苗的诞生被誉为人类医学最伟大的发明之一，它为人类筑起了一道预防疾病的绿色屏障。例如，由于天花疫苗的研发和接种，使得天花成为了被人类消灭的第 一种传染病。随着脊髓灰质炎疫苗的大规模接种，脊髓灰质炎病例在过去三十年中减少了99.9%以上。而人乳头瘤病毒（HPV）疫苗的出现，让宫颈癌变成了人类历史上第 一种能够通过疫苗预防的癌症。

病毒性细胞灭活疫苗制造工艺流程示意图

在上期IKA推文中提到流感疫苗的制备过程中，细胞培养这一步强烈推荐使用IKA HABITAT生物反应器。而疫苗的大规模生产还需要许多大型的实验设备，以病毒性细胞灭活疫苗生产工艺流程为例，在生产过程中，多次涉及溶液的配制，溶液的混匀乳化等操作，我们推荐如下设备：

IKA 工业级磁力搅拌器

Midi MR 1 digital

最 大转速：1000 rpm

最 大处理量(水)：50 L

Maxi MR 1 digital

最 大转速：600 rpm

最 大处理量(水)：150 L

I-MAG

最 大转速：1500 rpm

最 大处理量(水)：300 L

I-MAG 工业级磁力搅拌器专为大体积液体的搅拌应运而生：

• 强劲的搅拌动力，转速最 高1500 rpm

• 搅拌底座与控制面板分离式设计，使操作更灵活便捷

• 不锈钢搅拌盘面，防护等级高达IP64，不惧液体飞溅

• 可正反转和间歇运行操作，可外接脚踏开关控制运行

• 可预设10种搅拌程序，拥有定时功能，轻松实现无人值守操作

• 拥有以太网，USB和RS 232多种接口，可连接软件实现远程控制

• 具有温和软启动，防跳子监测，安全锁屏等安全功能，实现多重保护

IKA 中试级顶置式搅拌器

EUROSTAR 200 control

最 大转速：2000 rpm

最 大处理量(水)：100 L

EUROSTAR 400 control

最 大转速：2000 rpm

最 大处理量(水)：150 L

RW 47 digital

最 大转速：1300 rpm

最 大处理量(水)：200 L

EUROSTAR 400 control顶置式搅拌器特色优势：

• 最 大搅拌粘度高达100,000mPas

• 配移动无线控制器实现远程遥控控制

• 标配H67.60外置温度传感器，可测样品温度

• 可显示扭矩变化趋势曲线，监测样品的粘度变化

• 马达过压过载保护，拥有定时功能，可实现无人值守操作

• 拥有USB 和RS 232 接口，可连接软件远程控制和读取数值

IKA 中试级均质分散机

T 50 digital

最 大转速：10000 rpm

最 大处理量(水)：30 L

T 65 digital

最 大转速：9500 rpm

最 大处理量(水)：50 L

UTL 25 digital 

在线分散机

最 大转速：25000 rpm

最 大处理量(水)：无限制

样品输送流速：11.6 L/min

T 65 digital 分散机适用于中试级别液体的高速乳化分散：

• 大功率分散机，符合工业用电要求的三相电源设计

• 无级调速，转速数字显示

• 可选滚珠轴承分散刀具用于在真空或压力环境下处理样品

• 电机过载保护，IP54的防护等级，安全有保障

IKA 在混合分散技术上拥有深厚的积累，提供多款从中试到生产规模的磁力搅拌器、顶置搅拌器、均质分散机产品来助力疫苗的研发生产。

      Z近啊，有位客户找到我们，想要定制一台特殊的显微成像设备来做纳米材料的观察研究，那么，它特殊在哪里呢？

      首先这是一台偏光显微镜，明美偏光显微镜MP41，可广泛应用于地质、化工、YL、药品等领域的研究与检验，也可进行液态高分子材料，生物聚合物及液晶材料的晶相观察。

      你以为它是偏光显微镜就只能单纯的进行偏光观察？不，今天，我们打破了您的认知，它不仅可以进行偏光观察，还可以进行荧光观察，我们在偏光的基础上，给它加上了六孔荧光转盘，可实现荧光、偏光两种观察方式。

      是不是很惊喜意外，这还不够，它的光源系统，不是传统的汞灯、也不是卤素灯，搭配的是明美Z新的研发成果——大功率多波段LED光源，拥有发热减少，光源寿命增加、维护需求减少等特点，满足科研、分析、检验不同用户的需求，不仅可搭配我们公司的显微镜产品，也可匹配四的显微镜使用。

      另外，为了满足客户观察研究纳米材料的需求，我们还特地给它加上了明美高温热台，可帮助您观察记录材料在低温和高温变化过程中的状态和变化。

经过明美工程师的技术改造，Z终，它呈现在了我们的眼前。

（来源：广州市明美光电技术有限公司 ）

介绍和目标

免疫系统对癌症治 疗的反应可以反映患者在治 疗之后是否会有良好的结果。了解肿瘤微环境（TME）在肿瘤发生和治 疗反应中的变化对制定个性化的治 疗方案并改善癌症治 疗至关重要。借助稳定和全面的超多标成像技术，可使用免疫标志物探查髓系和淋巴系细胞的谱系和结构，而且结合特定肿瘤生物标志物时，还可以捕捉多种肿瘤中TME内的免疫反应。细胞类型特征模式，结合超多标组织成像的探查能力，可以针对免疫细胞群和TME内众多类型细胞的空间相互作用提供之前无法获得的全新认识。

Cell DVE超多标成像分析整体解决方案可以使用循环染色和染料失活流程对一个完整组织切片上的数十个生物标志物进行检测和成像。Cell DIVE的核心是一个精确、灵活、开放的多标记成像解决方案，可以灵活选择多标记成像研究中常用的生物标志物抗体。Cell Signaling Technology(CST)拥有丰富的经IHC验证的抗体组合，可检测TME中的关键蛋白质，实现组织中的免疫细胞检测和表型判断。CST提供抗体偶联物，这些偶联物均经过验证，可用于Cell DIVE上，并提供经IHC验证抗体与荧光团和其他检测试剂的定制化偶联。CST采用严格的IHC验证方法，随后还会在Cell DIVE平台上进行验证，可确保成功检测蛋白质。

在本研究中，我们展示了使用由数十种CST生物标志物抗体™组成的新型检测模式，在多种组织类型中进行的Cell DIVE超多标成像。多标记检测模式的开发所需的优化极少，可识别复杂的细胞类型，并揭示肿瘤微环境中的细胞间相互作用。

结 果

表征肿瘤微环境有助于理解导致患者预后不佳的新机制。肿瘤微环境比较复杂，通常在单个样本和不同患者样本中都是异质的。循环多标记染色和成像可在不同组织样本中实现TME探查，即使可用组织有限的情况下。在这项研究中，我们检查了12个完整组织或TMA切片中30多个生物标志物的表达（表1），重 点是潜在的免疫治 疗目标、预测性生物标志物和分割标志物。所有的CST生物标志物抗体均被连接并随机分配到一个回合。

表1.研究设计：抗体和组织

为了在TME中其他细胞的背景下定义免疫细胞，融合并分割了所有的生物标志物图像，并使用聚类分析和降维（UMAP）对表达进行分析。聚类分析提供了一个无偏见的方法来定义组织内的免疫细胞贡献。

在这项研究中，我们展示了人类结肠腺癌（CAC；图1）的聚类分析。在这里，聚类分析将白细胞从所有其他上皮细胞和基质细胞类型中区分出来（图1C）。此外，聚类清楚地定义了淋巴细胞和骨 髓细胞类别。CAC中的骨 髓类亚型包括骨 髓祖细胞、M2巨噬细胞和另外两个未知亚型的骨 髓聚类。其他生物标志物可用于进一步定义亚型。对于淋巴类，定义了T细胞和NKT细胞聚类。另外，还确定了一个具有CD20阳性的T细胞聚类。使用机器学习进行单细胞表型分析，可以从聚类中进一步定义细胞类型。例如，在图像1D中，聚类15中的一个细胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（图1D-E；橙色圈）。聚类和单细胞空间分析被应用于研究中的所有其他组织（图2；数据未显示）。

图1：CST检测模式的多标成像可在一张玻片上检查结肠腺癌（CAC）组织的免疫细胞成分（图1 A）。用多种生物标志物对玻片进行反复染色和成像（表1；图1 A、B、D板）。使用全套30种生物标志物进行分割后，聚类分析显示了组织内的免疫细胞（1C-H所示为CAC，正常结肠组织未显示）。聚类15（图1D-F）被突出显示，一个跨生物标志物的特定细胞用一个橙色的圆圈突出显示（图1D）。降维（UMAP；图1G）表示免疫细胞和其他聚类之间的关系。

图2：CST检测模式在多种癌症和正常组织类型中的多标成像。玻片被反复染色和成像（表1；图2组织类型）。所有生物标志物显示在一张图像中。使用全套30种生物标志物进行分割后，聚类分析显示了组织内的免疫细胞（数据未显示）。组织特定的免疫细胞聚类是由特定的生物标志物表达模式统计出来的。在聚类之后，单细胞表型能够对聚类中的细胞群进行空间分析。

方法和材料

CST抗体经过了严格的验证，以确保抗体在FFPE组织上的表现。本研究中的所有抗体都是直接偶联或商业偶联物成品（表1）。偶联是使用非位点特异性化学方法进行的。抗体与四种不同的染料过量偶联，去除未结合的染料，并通过分光光度分析测量标记的程度。经过初步验证，具有最 佳标记程度和浓度的偶联抗体溶液随后用于对各种人类癌症组织和正常组织的染色。组织从商业来源获得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI对组织进行成像，并自动进行自发荧光去除、校正和拼接。使用徕卡显微系统开发的专 利软件全拼接图像进行导入、融合和分析。

结 论

• 使用Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案，用30多种CST生物标志物抗体对12个完整的组织和TMA切片进行循环染色和成像。

•  这个CST检测模式能够识别含有不同免疫类别、细胞类型和亚型的细胞的集群。

• Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案可保存组织，未来进一步定义免疫细胞亚型的工作可以继续使用同一组织切片上的其他CST抗体，并与研究中所有先前的生物标志物叠加。

相关产品

超多标组织成像分析整体解决方案Cell DIVE

我们的日常经验表明，当寒流在下降时暖流在上升。这种众所周知的物理现象简单的描述了热对流过程的原理，这样的过程不仅出现在自然界中也同样出现在技术应用里。在自然界里，地球大气内部的温差会引起的湍流对流，其特征是无特征且混沌的空气运动，这使得预测连续几天的天气变得困难。

近年来，出现了很多显著大规模和长时间对流模式存在的报道[1]，[2]。这些所谓的上层结构主宰着的热量和质量转移，并可能导致气流的极大波动。这些上层结构是否有助于极端天气情况？这仍然知之甚少。

在德国伊尔默瑙理工大学热力学和流体力学研究所，科学家们正在研究热驱动流。该小组通过使用数值模拟和实验方法研究了，在这些流动中演化出的大量模式和旋涡的大小和动力学参量。

The Rayleigh-Bénard cell（瑞利-伯纳德装置）经常被用于实验。该模型实验让科学家通过分别加热和冷却顶部和底部的板层，在边界条件下引发热对流。如果两块板之间出现高温差，则在装置内部会形成湍流，这样在时间和空间则表现出与地球大气流动相似的特性。

除了数值模拟，该小组还进行了实验以获取有关上层结构的起源和动力学的详细信息。为了确定它们对热量和质量传递的影响，必须同时测量速度和温度分布。为此，该小组使用热致变色液晶（TLC）作为示踪剂颗粒。

当TLC被白光照亮时，温度分布可以通过其颜色确定。当使用粒子图像测速法（PIV）时，速度分布可以通过确定TLC在流体中的运动来评估。

除了新的评估方法外，例如 基于神经网络[3]，超连续谱激光器的重大技术进步也促进湍流对流的实验研究，因为这些光源提供了超 强且空间相干的白光激光束，从而能够以非常高的空间分辨率同时测量温度和速度[4]。

该小组建立了一个由装满水的小圆柱状Rayleigh-Bénard cell组成的基于超连续谱激光SUPERK LASER的RAYLEIGH-BÉNARD对流实验装置实验（请参见如下图），用于研究白光激光器对速度场和温度场的即时测量。超连续谱激光器（SuperK EXTREME EXR-20，NKT Photonics）与光学短通滤光片（SuperK SPLIT，NKT Photonics）耦合后，通过产生500 nm的薄光层，对悬浮的TLC进行白光照明。

实验装置由具有悬浮热致变色液晶（TLC）的Rayleigh-Bénard cell组成，可由超连续谱激光器产生的薄光层照亮。一台色敏相机用于检测从TLC散射的光。

在下面的画面中，您将看到白光激光器（SuperK EXTREME，NKT Photonics）如何从左侧照亮悬浮在Rayleigh-Bénard cell内水中的热致变色液晶（R20C20W型TLC，LCR Hallcrest）。

TLC既充当示踪剂颗粒又充当温度传感器。不但可通过应用“粒子图像测速”（PIV）确定了粒子位移，还通过评估其反射色可获取TLC的温度。

需要注意的是，配色方案与直觉相反：冷的红色羽流下降，而热的蓝色羽流上升。

参考文献

[1]  S. Emran, J. Schumacher, Large-scale mean patterns in turbulent convection, J. Fluid Mech. 776 (2015) 96–108.

[2]  Pandey, J.D. Scheel, J. Schumacher, Turbulent superstructures in Rayleigh-Bénard convection, Nat. Commun. 9 (2018) 2118.

[3]  Moller, C. Resagk, C. Cierpka, On the application of neural networks for temperature field measurements using thermochromic liquid crystals. Exp Fluids 61, 111 (2020).

[4]  König, S. Moller, N. Granzow, C. Cierpka, On the application of a supercontinuum white light laser for simultaneous measurements of temperature and velocity fields using thermochromic liquid crystals, Exp Therm Fluid Sci 109:109914 (2019).

1953年，科学家詹姆斯-沃森和弗朗西斯-克里克发现了DNA分子的双螺旋结构，遗传学的研究进入到分子层次，人们可以更深层的了解遗传信息的构成和传递途径（图1A）。近年，科学家在人类癌症细胞中发现一种四重螺旋体DNA分子——G-四链体(G-quadruplex)。它是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四分体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四分体通过π-π堆积形成四链体（图1B）。

有研究表明，G-四链体更多的出现在癌细胞等快速分裂的细胞中，与癌基因的启动子区域和DNA链的端粒区域相互作用。因此，G-四链体结构与DNA复制过程有着紧密联系，对于细胞分裂和增殖非常关键[1]。那么，通过靶向调控G-四链体结构将有望成为选择性YZ癌细胞增殖的新途径，G-四链体也成为了癌症ZL药物的重要靶标。

图1.A：James Dewey Waston（左）& Francis Harry Compton Crick（右）

B：G4-DNA的3D结构

鉴于G4-DNA参与到很多生物过程当中，开发用于检测和可视化细胞中 G4-DNA 结构的工具也尤为重要。伦敦帝国理工学院的研究人员开发了一种能够在活细胞中检测G4-DNA的荧光探针——DAOTA-M2，为人们揭开了这种结构的神秘面纱 [2]。

这种探针具备良好的活细胞渗透性和低细胞毒性，在与G4-DNA结合时会发出荧光，可以用来观察G4-DNA是如何与活细胞内的其他分子相互作用的。并且当DAOTA-M2与不同的核酸拓扑结构结合时，将显示出不同的荧光寿命信息，进而可以区别双螺旋DNA和G4 DNA（图2），因为与四链体结合时荧光寿命更长（图3）。

图2. 荧光寿命置换测定的示意图：竞争对手结合后，DAOTA-M2 从 G4-DNA 转移到 dsDNA环境，导致其荧光寿命缩短

图3 DAOTA-M2染色的活细胞U2OS细胞核DNA的FLIM分析（a）以 512 × 512 分辨率（λex=477 nm，λem=550–700 nm）记录的荧光强度图像，红线表示用于 FLIM 分析的核分割（b） 来自 a 的 FLIM 图，显示在平均寿命 (τw) 9ns（红色）和 13ns（蓝色）之间（c） 平均核强度与平均核寿命（蓝点）的二维相关性（d）单个原子核的放大 FLIM 图 - 颜色代表寿命，由 9ns（红色）和 13ns（蓝色）之间的颜色梯度条定义

G4-DNA的生物功能是通过动态的折叠和打开实现。在细胞内，G4-DNA可以自发折叠，但其打开是由专门的解旋酶来完成。并且在接下来的研究中，科学家发现哺乳类动物中的DNA 解旋酶 FancJ 和 RTEL1的表达量减少将会导致DAOTA-M2荧光寿命变长（图4）[3]。因此可以直接利用DAOTA-M2荧光寿命的变化监测G4-DNA在活细胞中的动态变化。

图4，减少 FancJ或RTEL1 解旋酶表达如何导致更长的 DAOTA-M2 寿命 (τw)的示意图

G4-DNA被认为是潜在癌症ZL药物靶点，因此评估给定的 G4-DNA靶向药物与该结构结合的能力将非常有用。通过不同处理后DAOTA-M2的荧光寿命变化，结果显示双羧酸功能化的Ni（Ni-salphen）与G4-DNA有很强的靶向结合能力，会在短时间内导致DAOTA-M2荧光寿命迅速下降。（图5）

图5. 加入结合剂1-7hr的DAOTA-M2 的代表性 FLIM 成像结果（显示在 6ns（红色）和 14ns（蓝色）之间）共孵育后 使用 DMSO（对照）、Zn-salphen、Nisalphen 。比例尺：20 μm

在以上的科研工作中，不难发现，JZ的检测方法是必不可少的，比如贯穿于整篇文献中的FLIM技术。FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，荧光寿命成像）：是一种基于荧光寿命的显微成像技术，其成像结果提供像素位点的寿命信息，使得我们在荧光强度成像之外，能更加深入地对样品进行功能性测量。荧光寿命成像具有不同于荧光强度成像的众多优点，如不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响。会因为分子构象、分子间相互作用、分子微环境、生理状态等条件改变而发生变化。Leica全新STELLARIS 8 FALCON荧光寿命成像系统，搭载新一代白激光（440-790nm）以及HyD X高灵敏度专用检测器，提供超快速、多维度荧光寿命成像解决方案。

将特异性探针与FLIM相结合使用，不仅可以用来监测活细胞细胞核中G4-DNA的形成，以及判定小分子药物与G4-DNA的相互作用，还可以应用于G4-DNA靶向药物的筛选。这些信息将为癌症的诊断和ZL带来了新启示，更有助于靶向性新疗法新药物的开发。

了解更多：https://www.leica-microsystems.com.cn/cn/?nlc=20201230-SFDC-011237