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在雌性哺乳动物寿命中的任意时间，卵巢内都含有许多卵泡。但随着年龄的增长，卵泡的顺序活化ZZ使得卵巢的储备耗竭，从而导致更年期和不育。因此，卵巢内卵泡的数量和分布是卵巢健康和生育能力的可靠标志，卵泡的评分和分类已成为卵巢的生物学研究中评估生育能力的金标准。传统的卵泡计数方法依靠石蜡对卵巢包埋、切片、染色后进行人工的计数和分期，这项工作非常耗时、劳动强度大且不同研究的分类标准差异很大。尽管此前已有机器辅助的高通量卵泡分类技术，但这些研究依然是基于卵巢的组织切片。为了避免偏差并加快卵泡的评分过程，我们希望的计数方式是依赖完整的卵巢组织3D图像而不是组织切片。

近年来，透明化技术的快速发展和光片显微镜的应用，使得小鼠卵巢的三维结构得到了有效的评估，且定量研究了卵泡的直径、体积，并定位了不同卵泡处于卵巢中的位置（Yi F. Imaging the ovary. Reprod Biomed Online. 2018），文中讨论了卵巢组织的3D成像新方法。

A．使用Clarity方法处理小鼠卵巢前后的样本变化；B. Clarity处理后对样本进行2D、3D成像

最近，Biology of Reproduction发表了一篇新的有关卵巢的研究（Jennifer M. Biol Reprod. 2020），作者希望通过一种优化的透明化小鼠卵巢的方法，对成年小鼠卵巢中的卵泡储备及生长情况进行快速而准确地评估，为自动化计数模型的开发提供支持。

由于缺乏卵巢细胞特异性的荧光报告基因，以及欲使用的光片显微镜对成像液的限制性，因此作者需要一种与免疫标记和抗体渗透兼容的透明化方法。经过初步实验后作者发现：CUBIC透明化方法仅7天就可使小鼠卵巢变得透明，且MSY2抗体标记的对比实验表明：CUBIC方法与所使用的抗体兼容性良好（图1）。

图1：对小鼠卵巢应用CUBIC方法的抗体标记实验（scale bar: 300μm）

经过一系列的方法优化之后，作者对AmhCre转基因小鼠进行了3D成像，以验证CUBIC处理后的小鼠卵巢是否足够透明且均匀标记，以实现卵巢的整体成像。Tomato标记的成像结果证实了该方法对内源性信号的保护性良好，但Hoechst DNA的成像结果则表明完整卵巢尚未完全透明。此外，ENDOMUCIN对卵巢血管的标记则表明只有卵巢表面可以渗透抗体（图2）。

图2：AmhCre转基因小鼠卵巢的3D成像结果（scale bar:300μm）

从已发表的文献中，作者了解到iDISCO透明化方法可以完全透明化样本，且该方法与免疫染色兼容，但由于欲使用的光片显微镜对于成像液的限制，使得iDISCO方法与其不兼容。因此作者提出是否可以在iDISCO方法后添加CUBIC透明步骤，以在前一步的透明化结束后将样本过渡到水溶液中，但仍保留理想的iDISCO透明化结果，以实现组织的整体3D成像（图3）。

图3：iDISCO+CUBIC实验流程

作者将iDISCO+CUBIC与单独的CUBIC方法进行比较，发现荧光信号在整个组织中均可检测到（图4），证实了结合后的方法对小鼠卵巢具有更高的透明化程度与更好的抗体渗透性（图5）。

图4：两种方法的透明化前后对比（scale bar: 1mm）

图5：iDISCO+CUBIC方法的抗体渗透性验证（scale bar: 300μm）

为了快速而准确地评估小鼠卵巢中的卵泡储备，作者接下来分别免疫标记了卵泡和卵母细胞并进行了3D成像，结果发现新的卵母细胞标记物HuC/D较标准抗体标记的MVH具有更好的信噪比（图6）。

图6：不同标记物的3D图像（scale bar: 400μm）

此外，作者也表明该方法也可对卵巢内部完整的血管（图7A）和神经网络（图7B）进行成像。

图7：小鼠卵巢的血管和神经的3D图像（scale bar: 400μm）

作者认为：开发高通量的计算工具，首先需要一种快速、GX的方法对小鼠卵巢进行透明化，且需要开发其它可兼容的抗体对组织内的单个结构进行标记。作者证实了该方法可以快速、准确地评估卵泡，并利用软件进行了卵泡储备分析，此外也利用3D图像证实了卵巢成分的完整性。

锘海LS18光片显微镜

锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司自主研发的LS18平铺光片显微镜，克服了传统光片显微镜3D空间分辨率、Z轴层析能力和成像视野之间的矛盾；摒弃原有选择性平面照明显微镜中的单光片照明的方式，运用多个薄的光片分段照明，在不损失成像视野的情况下，获得更高分辨率的3D图像。LS 18光片照明显微镜适用于各种不同类型透明化方法处理的样品（水性透明化方法如Scale、SeeDB、CLARITY、CUBIC、SWITCH、SHIELD等；油性透明化方法如BABB、3DISCO、iDISCO、uDISCO、PEGASOS等），都可得到高分辨率、高信噪比的多色荧光3D图像，能够快速定位宏观样品中的目标细胞，获得高分辨率的3D细胞微结构。

锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司

锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司是一家创新型的科技公司，拥有自主研发及独立生产能力。锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司致力于生命科学领域，为高校、科研院所、医院及企业提供实验仪器、试剂耗材、CRO/CMO技术服务等一站式整体解决方案，满足产业中的研发和生产需求。

针对大组织样品的3D荧光成像，锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司采用与西湖大学高亮（平铺光片技术发明人）实验室共同研制的光片照明显微镜Nuohai LS 18，其运用创新的平铺光片技术，克服了传统光片显微镜中空间分辨率、光学层析能力和成像视野大小之间的矛盾，从而获得均匀高分辨率的3D荧光图像。

同时锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司成立了脑科学与组织工程人工智能技术研究院，作为第三方检测服务平台，为各地高校、科研院所、医院及企业提供专业的检测研发服务。我司提供从完整器官与组织的透明化，免疫荧光染色，大样品高分辨3D显微成像到大数据分析一体化服务，旨在通过准确、快速、多样化的一体化研发服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化解决方案。 

摘要

工具钢是一种非常重要的材料,它的化学成分组成从简单的塑性成型的模具钢和水淬硬化碳钢到高合金的高速钢. 这些材料都有一个共同的特点——铁基材料。在工具钢和模具钢的失效分析中,有时会观察到各种各样我们不希望出现的显微组织。

一般而言，工具钢的金相样品制备不是特别困难。但是，还是有些问题需要注意。

首先其切割过程值得注意，为了避免过热和过烧，切割片必须选用粘结强度较低的切割片。

在样品制备过程中，样品的边缘保护非常重要。例如：脱碳层评判的样品，热处理后的失效的样品尤其如此。

在样品制备过程中防止夹杂物的脱落非常重要，特别对于那些需要对夹杂物含量和类型需要评判的。对于含有石墨的工具钢，石墨必须正确保留。对于Si含量较高的工具钢斑点染色问题经常会遇到。

碳化物在样品制备时会破裂甚至从基体上脱落变成孔洞，对于合金含量较高材料在切割时要特别注意。金相工作者必须能够判别这些孔洞是材料本身存在的还是在样品制备过程中产生的。

工具钢的制备流程

01 切割

相对较软的样品（硬度低于35HRC或345HV）可以使用钢锯或者带锯进行切割。

对于高硬度的样品切割必须使用砂轮切割片，在切割过程中使用水进行冷却，切割片应使用粘结强度较低的砂轮片以防止样品过烧。

对于淬火后的高合金工具钢，这样的材料相对较脆，切割时比较容易得到平坦和损伤层小的切割表面。在精密切割机上使用金刚石或立方氮化硼刀片切割高硬度的高合金工具钢可以获得最 小损伤层的高质量切割表面。

02 镶嵌

通常较大的样品不需要镶嵌就可以直接进行抛光。如果样品边缘需要被保护的样品，就必须进行镶嵌。

镶嵌主要用于小和形状不规则的样品。

如果对于样品的研磨抛光位置有特定的要求，那么就可以使用透明的丙烯酸热镶嵌树脂。

冷镶嵌的环氧树脂主要用于样品对于温度敏感和那些不能承受压力的样品。

03 研磨与抛光

在传统的方法中，无论是手动还是自动抛光在研磨阶段，通常使用的SiC砂纸,水冷（200~300mm或8”~12”直径）。最初研磨砂纸粒度的选自取决于切割后的样品表面状态。

传统的方法中，抛光阶段采用多步金刚石抛光液，最 后抛光阶段采用氧化铝抛光。最 终的抛光步骤采用手动或自动均可。

总之，由于工具钢的高硬度所以抛光时很容易去除样品的划痕和人为缺陷。

现代的方法是使用自动化的设备进行研磨和抛光的，镶嵌或未经镶嵌的样品被放置到各种尺寸的样品夹持器中，抛光盘的直径通常为200，250或300mm直径（8”,10”或12”）。使用最 新的制备方案只需3个步骤就可以得到令人满意的抛光表面。

下表1的四步抛光方法可以得到高质量的抛光表面来适合所有需求；表2显示的是一个更为简捷的3步制备方法。

表1. 工具钢四步法制备

表2. 工具钢三步法制备

图1. 用3步制备方法制备的O6石墨工具钢显微组织

04 腐蚀

2%~10%的硝酸溶液作为工具钢的侵蚀液。通常2%~3%的硝酸溶液可满足大多数工具钢的侵蚀，10%硝酸溶液适用于高合金工具钢，例如D型钢的侵蚀液。

硝酸乙醇腐蚀液常用于显示马氏体组织，苦 味酸（4%的苦 味酸乙醇）溶液常用于退火的工具钢样品的检测。

注：在配置溶液时尽量用乙醇替代甲醇，甲醇有累积性毒物所以尽量少用。

总结

如果想要得到真实的显微组织，正确的样品制备过程必不可少。使用现代的半自动磨抛设备可以快速的进行样品制备而且能够得到令人满意的工具钢样品。在便捷的3步样品制备和4步样品制备工艺中已经提到样品制备的关键参数控制。

1. 切割过程选用硬度合适的金相专用的砂轮切割片，以避免过大损伤的产生。

2. 如果样品边缘需要检查，就要选用保边性好的树脂进行镶嵌。

3. 最 初的研磨工序，尽可能使用粒度较细的砂纸。

4. 在抛光过程中，添加足够的抛光液，才能做到有效的材料去除。

5. 在最 终抛光时，抛光布使用无绒毛、编织或压制的织物进行表面抛光。

6. 选择最 适合的腐蚀剂清晰显示显微组织并得到最 好的图像衬度。

       为了显示材料的真实显微组织，准确的观察、辨别、记录和测量，正确的试样制备过程是必不可少的。试样的制备质量是决定检测结果的关键因素，犹如那句经典的计算机谚语所说：“如果输入的是垃圾，那么输出的也是垃圾。”

      标乐是材料制备和分析领域的ling导者。作为标乐金相制样的dai理商，我们不仅提供齐全的设备和耗材，更有团队为您提供需要的应用知识、技术支持和服务。今天我们为大家带来的是陶瓷金相制备的经验分享：

【陶瓷】

       陶瓷材料特别硬和脆，可能含有孔洞，必须用金刚石切割片切割。如果试样需要热腐蚀，那么试样镶嵌时就必须考虑样品还要从树脂中取出，此时环氧树脂真空填充孔洞可以不考虑。由于陶瓷自身的特点，不需要考虑变形和塑性流变的问题，但制备过程中可能会产生裂纹晶粒破裂的问题。

热压氮化硅组织 (不知名的黏结剂)

(未腐蚀，500X )

       脱落是陶瓷制备的主要问题，因为通常会把脱落当成孔洞。研磨方法采用金属黏结金刚石盘，硬研磨盘或硬抛光布的机械制备方法。SiC砂纸对陶瓷材料几乎无效，因为两者几乎一样硬。因此在所有的制备步骤中，几乎全部使用金刚石。陶瓷材料制备时的载荷比较高，经常超过手工制备的载荷。本篇文章中列出了两种常用的陶瓷制备程序。

MasterPolish 2 悬浮液用于陶瓷Z后的制备步骤，获得的表面光洁度要高于1μm的金刚石抛光。

【陶瓷材料】

方案一：

方案二：

【实用小贴士】

      使用切割片，在尽可能靠近需要制备、需要检查的平面处进行切割，这样除了把可能的损伤量降到Z少外，还能为随后制备提供Z佳的表面。粗磨相当慢，应尽量想办法避免组织结构的损伤。

      制备时候可能需要粗的研磨剂。然而，粗的研磨剂可能导致严重的晶粒脱落，因此在研磨过程中，尽量使用细的研磨剂以减少晶粒脱落现象。

难熔材料组织：铝(基体)，氧化锆(灰色)，硅(白色) (未腐蚀，200x)

Si-SiC 陶瓷 10%草酸电解腐蚀(500X)

（来源：上海西努光学科技有限公司）