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       颗粒学研究包罗万象，嫁接到不同领域成果斐然。其中生物制药向的颗粒学研究；与环境、健康息息相关的气溶胶研究；不断向“小”进军的超微及纳米颗粒研究；以及颗粒检测与表征新技术研发都是近年来颗粒学研究应用的热区之一。特别在疫情之下的2020，更成为社会舆论关注的焦点。

      基于此，4月9日-4月10日，行业网站与ZG颗粒学会联合主办首届“颗粒研究应用与检测分析”主题网络大会。分设生物制药颗粒、气溶胶、超微及纳米颗粒、颗粒检测与表征四个分会场，邀请21位享誉业内，从事颗粒学从事颗粒学研究的学术大咖剖析、讲解颗粒学研究应用及检测分析的前沿热点和疑难杂症。

珠海真理光学仪器有限公司很荣幸被邀请在生物制药颗粒专场做报告“药物粒度分析的方法开发与验证”。

        报告人：秦和义，珠海真理光学仪器有限公司商务总经理， ZG颗粒学会理事会理事、全国颗粒表征与分检标准化技术委员会颗粒分技术委员会委员、ZG颗粒测试专业委员会及学术委员会委员 。从事颗粒表征和粒度分析工作25年，曾任英国马尔文仪器ZG技术与应用经理及ZG区总经理、英国富瑞曼科技有限公司ZG首席代表，在颗粒粒度测试技术和应用领域具有丰富经验和认知。

        报告摘要：药物颗粒的粒度分布直接影响药物的释放和生物利用度，由于药品质量控制的特殊性和高要求，所有药物粒度的分析仪器性能和测试方法都需要确认和验证，以保证测试结果的一致性和重现性。本报告从应用角度阐述粒度分析仪器性能认证的意义并探讨药物粒度分析方法开发和验证的要素及步骤。

      直播报告气氛热烈，引起大家的热烈讨论和关注。【真理光学】将继续在颗粒表征领域发光发热，贡献力量。

近年来USP和ICH都针对分析方法开发与验证进行了修订。USP新收录通则<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，分别从分析方法开发、分析方法性能确认及分析方法使用三个阶段分别阐述如何在分析方法整个生命周期内对方法进行管理。而ICH Q14分析方法开发和Q2(R2) 分析方法验证的修订也进入到了第三阶段，按照计划其将在2023年5月前完成阶段的定稿。这些信息都表明了分析方法开发和验证的管理将会变得更严谨、更科学。

因为色谱仪器包括色谱-质谱联用技术在药物开发过程中的广泛使用，色谱分析方法的开发与验证也成为了方法开发与验证，乃至分析方法生命周期管理中的重要内容。针对色谱方法开发与验证的整体流程，可以将其大致分为：方法筛选、方法优化、耐用性测试和完整的方法验证这四个阶段。

而这四个阶段都离不开仪器准备、队列运行、数据查看与处理以及报告这几个环节。赛默飞的旗舰版色谱数据系统Chromeleon 软件功能丰富而注重实践，能够帮助实验室的色谱分析实现精简、高效的工作流，以实现更快的样品到结果的转换。

自定义变量的灵活应用

在Chromeleon CDS 中创建队列时可以通过手工填写的传统方式，也可基于事先建好的队列模板。值得一提的是Chromeleon 强大的样品列表功能。除了运行样品的基本信息（样品名称、仪器方法、运行的其他必须参数）之外，还可以通过自定义变量的形式，添加额外的注释信息，例如色谱柱类型、缓冲液名称等用于清晰识别每一针进样的信息。

使用者还可以进一步创建一些自定义变量并将其与仪器方法中的参数进行链接，更加简单地实现实验设计（DoE）的环节。一旦基本方法固定，便可通过改变色谱柱选择阀或溶剂选择阀等参数实现不同要素的组合以寻找具备可行性的色谱条件，也体现了ICH和USP所倡导的“多变量分析方法开发”这一方针。相比传统的样品队列创建方式，减少了所需创建的仪器方法的数量，并以清晰直观的模式展示了所使用的变量以及变量值，结合缩略图功能提供了更直观的信息。

在数据处理阶段，可以再次利用Chromeleon 样品列表中的自定义结果变量功能，可以方便地实现运行样品的同时进行结果计算，例如系统适用性参数的计算，峰面积、含量以及测试是否通过等信息的显示，帮助使用者快速查看所需信息以便灵活调整实验的方向。

完全可定制的

Chromeleon

报告模板也支持自定义变量、公式和计算，使用者可以使用内置的模板，也可以根据需要进行调整，得到包括多个工作表、结果表和图形的报告，无需导出到其他软件，也无需手动计算，从而消除转录错误。所有报告和计算都可以在合规的环境中完成，并在源数据发生变化时自动更新。可以选择在运行结束时自动打印、导出也可以发送电子邮件通知给相关人员。

更便捷的eWorkflow

Chromeleon 也提供一个创建序列、运行并得到结果的简单而直接的方法，这就是eWorkflow。它最 大限度地减少了操作步骤并涵盖了色谱或 MS 工作流程的所有方面，定义了可以在哪些仪器上运行分析以及应该使用哪些方法和文件，包括仪器方法、处理方法、报告和外部文件，例如 SOP。 

与前面提到的自定义变量等有效结合，只需单击几下即可创建复杂的序列并立即运行，并在运行后得到所需的报告。这些都可以减少错误、更快地产生可靠的结果，并且显著减少了培训的需求，有效加速了方法开发的流程。

分析方法验证工具包

ICH指南定义了方法验证应该执行包括专属性、准确度、精密度、检测和定量限度、线性、范围和耐用性的测试。除了样品运行的环节之外，计算、整理和报告验证结果也可能需要很长的时间，而且大多数测试都涉及将结果与指标进行比较，相对比较繁琐。 

在eWorkflow的基础上，Chromeleon 又提供了一个方法验证的高效工具，ICH方法验证扩展包。扩展包内有一系列的模板，每个模板都包含处理方法、报告模板和自定义变量以覆盖所需的变量和参数。所有这些都在 eWorkflow 程序中捆绑在一起，以确保正确执行ICH所要求的相关测试，减少人为错误并加速流程：eWorkflow 可以引导创建队列，自动执行所有计算，并通过报告直接显示通过或失败的结论。

以上介绍的几个工具仅为Chromeleon 强大功能的冰山一角。结合Chromeleon 实用的多厂商仪器控制能力，出色的系统适用性和智能运行控制功能，便捷的数据积分、处理功能，直观的图形化显示，全面的合规能力，Chromeleon不但可以提升方法开发、验证的效率，也一定能够帮助色谱工作者执行分析方法生命周期的管理。

动态光散射 (DLS) 正在成为制药行业中越来越流行的亚微米级药品粒度分析技术。本技术说明试图为使用此技术进行方法开发和验证放行测试的客户提供指导。

1、方法验证

分析方法验证是证明分析程序适合其预期目的的过程5。并非所有验证特征都适用于粒度分析。较早的 FDA 工业指南（非实施）草案文7包括一个专门针对粒度分析的部分。尽管较新的已发布文件取代了较旧的指南草案，但有关粒度分析的较旧部分提供了有关粒度分析与其他技术（如 HPLC）的不同之处的见解。旧文档中的以下声明有助于方法验证工作：

“方法验证通常涉及中间精度和重复性的评估。应保证生成的数据是可重复的，并控制产品的质量。”7

考虑到这一评论，下面提供了解决 DLS 方法验证的建议

● 特异性：N/A，DLS 检测大小变化但对不同化学物质不敏感。

● 线性：N/A，DLS 没有任何线性关系。

● 准确性：N/A，仪器的准确性使用标准粒子进行验证，但缺乏公认的定量裁判方法（SEM/TEM 显微镜）不包括准确性确定。包括样品的 SEM/TEM 图像以支持方法验证可能是更合适的。

● 精密度（重复性、中间精密度和重现性）：这是需要重 点关注的地方。通常这些术语的定义在粒度分析领域可能不同于其他技术。以下评论来自粒度分析领域：

     重复性：多次测量样品。

     重现性：准备样品、测量、丢弃、清洁、重复。建议的方法是制备五份样品，然后对每个样品进行五次分析。

     中间精密度：此活动涉及第二位分析员、第二台仪器或两者兼而有之。如果所有测试都在一个地点进行，则由同一系统上的不同操作员在不同日期分析同一批次的样品。如果要在多个地点进行测试，则同一样本（或批次）由不同操作员在不同地点的不同系统上进行分析。

● 范围：N/A，仅在所用系统的工作范围内工作。无需对此进行测试或记录。

● 定量限：N/A，这只是测试粒径。

● 检测限：N/A，方法开发应确保样品在系统检测限内。

一旦一种方法得到验证，该程序就应该用于产品的生命周期。如果需要重复调整，则应重新评估和重新验证该方法。

2、结构示例

两名操作员在两个 Nicomp DLS 系统上分析了一种药物物质（异丙酚乳剂）。该样品已过期，但仍显示符合 USP <729> 的合格结果。仪器设置如下：

Instrument A：

Instrument B：

3、方法开发

首先分析 92 nm PSL 标准以确保适当的系统性能。测量结果在预期值的 98% 以内。建议在开始此类工作之前进行此验证测试。

接下来进行快速研究以测试浓度（稀释）的影响。参见图 1 中的结果。

将 10 滴样品加入 15 mL 去离子水中并进行分析。重复相同的制备。然后将这些样品按 2:1 稀释并进行分析。样品看起来太浑浊，结果发生变化，因此将下一滴添加到 15 mL DI 水中。样品出现轻微混浊，这些结果是可以接受的。有时，稀盐溶液是比纯去离子水更好的稀释剂。下一步是将一滴样品加入 10 mL 过滤后的 10 mM KCl 溶液中。这些结果似乎更好，因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他测量。

在进行稀释研究时，分析时间也从3分钟到10分钟不等。三分钟、五分钟和十分钟分析时间的时间曲线图如图2-4所示。红色=光强粒径平均值，蓝色=体积粒径平均值，蓝色=数量粒径平均值。

该方法选择了5分钟的分析时间。在五分钟的分析时间完成之前，光强平均粒径结果已经稳定下来。但直到大约9分钟前，体积和数量加权平均结果仍在变化。这是也是在使用DLS时仅选择光强粒径结果的一个原因。这可能是方法开发中测试重复性很好的一个点。在这种情况下，也许下一个测试的分析时间是四分半、五分和五分半钟。在这项研究中没有执行这一步骤，值得指出的是，整个方法开发和验证研究在不到8个小时内完成。更严格的最 终发布测试方法开发和验证方法很可能需要至少几天时间。

4、样品准备

——在干净的瓶子里装满10毫升过滤后的KCl溶液

——用针头注射器取出0.5毫升异丙酚

——在瓶子里注入1滴异丙酚和10毫升KCl溶液

——手旋转直到完全混合(10秒)

——用一次性移液管将400μL样品移入圆形一次性玻璃样品池

——将玻璃样品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打开样品盖

——将样品池和支架插入Nicomp系统，Holder支架背向Nicomp的左侧

——关闭Nicomp上的样品盖

确保仪器设置与如下所示的值匹配：

——单击绿色“G”图标开始测量

——打印并记录平均直径、标准偏差、PI 、D10、D50 和 D90

——将结果输入 Excel 电子表格

——计算五项分析的平均值和变异系数

——比较两个数据集

5、结果

样品在 A 和 B 系统上独立制备和分析。每个样品分析五次以检查重复性。这两个系统的示例结果如图 5 和图 6 所示。

整个结果以表格形式显示在图 7 和图 8 中。五个结果的叠加如图所示。

6、结论

查看综合结果可以得出以下几点观察结果：

——即使是相隔数年生产的两个系统也会生成相似的数据

——两个系统之间存在明显的 3% 偏差

——PI计算可能不是用于定义宽度分布的最 佳值

——如果使用PI，则30%的差值似乎是合适的

——D10、D50、D90 结果显示出更好的重现性，可能更容易为制药行业所接受

纯粹基于该数据集，基于三个测量的该药物产品的规格可能类似于：

——光强平均值 = 200 nm ±20%，COV = 小于 20%

——D10 = 140 nm ±30%，COV = 小于30%

——D90 = 284 nm ±30%，COV = 小于 30% 或

——PI = 0.09 ±30%

上述建议规格仅来自观察到的重现性，可能对药物安全性或有效性没有任何影响。USP <729> 中的实际是否通过标准的要求只是粒径尺寸必须低于 500 nm 并且具有低x2值。质量标准的另一种方法可能是关注影响有效性和/或安全性的粒径大小。本技术说明收集的数据是让您了解 DLS 技术对于简单样品的可重复性/重现性

7、仪器介绍

Nicomp纳米激光粒度仪系列

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然显示较好的分辨率和准确度。

高斯粒径分布图                         多峰粒径分布图 

参考资料

1 USP <729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions,http://www.usp.org/

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS),https://www.iso.org/home.html

3 USP <429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size,http://www.usp.org/

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015,https://www.fda.gov/media/87801/download

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods

Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation

动态光散射 (DLS) 正在成为制药行业中越来越流行的亚微米级药物粒度分析技术。本技术说明试图为使用此技术进行方法开发和验证放行测试的客户提供指导。

1、引言

虽然 DLS 在制药行业广泛使用，但关于方法开发和验证主题的文章很少。唯 一提及 DLS 的药典测试是 USP <729>脂质注射乳剂中的球体大小分布。1 因此，本文提供了有关在制药行业中使用 DLS 的一些见解。

2、USP<729>

此标准要求使用 100、250 和 400 nm 三个尺寸规格的 PSL 标准粒子来验证 DLS 系统。本文作者不理解为什么选择这些粒径，尤其是合格/不合格的标准是 500 nm。

许多使用DLS 的专家认为，仅以一种粒径进行测试应该即可验证系统是否正常运行。对这些标准进行3次测量，强度加权平均粒径和标准偏差应与预期值在可接受的误差范围内一致。而可接受的度是根据“在可接受的误差范围内”给出的。也许平均粒径在 ±10% 的范围内是合理的。

系统适用性部分指出，如果 CV 不超过 10%，则分析标准品时的重现性符合标准。通过 USP <729> 测试要求强度平均粒径小于 500 nm (0.5 µm) 并且卡方值 (x2) 保持“可接受的低”。Nicomp® 用户手册指出，良好的高斯结果的卡方值低于2 - 3。因此卡方值 <3 表示通过结果。

3、质量标准说明

因为USP <729> 测试是唯 一使用 DLS 的药典专著，其质量标准设定值得考虑，但药典质量标准不一定适合所有药物。一种更常见的规范方法是定义强度平均值的值和范围以及与分布宽度相关的一些计算。DLS 的 ISO 标准建议关注强度平均值和多分散性指数(PI)。2

作者看到的一些 DLS 规格包括 D10、D50 和 D90 的值。这些值可能来自制药行业广泛使用激光衍射进行粒度分析。USP <429> 测试光衍射测量粒径3经常使用 D10、D50 和 D90。设置质量标准的另一种方法是从USP<429>中借鉴重现性相关内容， USP <429> 中“重复”部分给出的基于体积分布的重现性范围为：

● D50 = 10%

● D10, D90 = 15%

● 在 10 µm 以下，这些最 大值可以加倍

遵循这些指南的内容，DLS 规格（根据定义尺寸小于 10 µm）对于强度平均值可以是可重复的 ±20%，对于 PI 或其他计算结果指示分布宽度是可重复的 ±30%。对于某些药品，这可能是一个可以接受的范围，但要注意当粒径非常小时出现的统计问题。如果平均粒径为 500 nm，±20%，则范围为 400 – 600 nm，这还不错。但对于平均粒径为 10 nm 的蛋白质，范围则为 8-12 nm，这样的粒径跨度变得非常挑战且难以接受。

4、方法开发

在开发方法之前，需要调查样品制备问题。这可以从简单的（将样品移入比色皿中）到复杂的（用表面活性剂和超声波分散）。样品制备的主题超出了本文档的范围，但已在之前的技术说明中讨论过。4 使用 DLS 制备样品进行分析时需要考虑的一些建议包括：

—— 测试浓度的影响。测量、稀释并再次测量。

—— 测试测量时间的影响。测量 3、5 和 10 分钟。

—— 确保任何稀释剂都经过充分过滤。WFI 可能不够干净。

—— 确保使用样品池都足够干净。

—— 是否应使用过滤器去除样品中的大颗粒？

—— 哪个样品池合适。

—— 调查任何可能影响结果的仪器设置。

优化样品制备步骤和仪器设置后，就可进行测试重复性实验。调查分析时间的微小变化是否对结果有任何重大影响。如果该方法需要 5 分钟的分析时间，则在 4 分 30 秒和 5 分 30 秒时测试。检查结果是否相同。

一旦方法得到优化，下一步就是按照标准 FDA 指南记录该方法。5 目标是足够详细地描述程序，以便其他操作员可以执行相同的测试并生成相同的结果。列出了必须包含的基本信息：

—— 原理/范围：分析测试/技术的基本原理。

—— 装置/设备：仪器类型、激光、检测器、检测角度和样品池类型。

—— 操作参数：温度、粘度、分析时间和通道宽度。

—— 试剂/标准品：用于验证性能的聚苯乙烯乳胶 (PSL)。PSS 建议使用 90 nm PSL（请参阅 Entegris 技术说明 - 系统验证）。

—— 标准控制溶液制备：稀释剂，稀释。6 

—— 程序：程序的逐步描述。将准备好的样品放入比色皿中，放入到系统中，定义参数并进行测量。

—— 系统适用性：测试以确保系统在使用时能够正常运行。6

—— 计算：所有结果计算通常直接在DLS 系统操作系统软件中进行。8 可以在电子表格中进行额外的统计计算。

—— 数据报告：数字数据、格式、有效数字的表示。Entegris 建议将结果重 点放在光强强度加权平均直径上。

5、关于参考标准和材料的说明

如上所述，我们认为单个粒径的测试足以验证系统是否正常运行。多家供应商提供多种粒径标准品，客户可以选择他们推荐使用的样品。但Entegris对两种 PSL 标准粒子拥有丰富经验，这些也是我们通常建议客户用来验证其 Nicomp6 的样本。Thermo Fisher 3000 系列 NIST 可溯源 90 nm 标称 PSL 标准通常用于验证 Nicomp 性能。样品的目录号为 3090A，认证值为 92 ± 3 nm。另一个经常使用的样品是 Thermo Fisher 目录号 5009A，值为 90 nm。该样品不可追溯到 NIST，但我们有足够的经验推荐使用该样品，而且它比 3000 系列产品便宜。

注：DLS 是一种不需要校准的第 一原理技术。该系统使用一种或多种 PSL 标准进行验证。如果系统未通过验证步骤，则无法进行调整以使结果进入预期范围。验证结果失败可能是由于系统工作不正常而需要维修，或者更常见的是标准粒子准备不当，应在尝试另一次测量之前重新准备。

6、仪器介绍

Nicomp纳米激光粒度仪系列

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然显示较好的分辨率和准确度。

高斯粒径分布图                     多峰粒径分布图

参考资料

1 USP <729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions,http://www.usp.org/

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS),https://www.iso.org/home.html

3 USP <429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size,http://www.usp.org/

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015,https://www.fda.gov/media/87801/download

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods

Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation

在仿制药体外研究中，需测定不同粒径的原料药的溶解度，考察粒径大小对溶出度的影响，找出能够把溶出曲线区分开的不同粒度范围。随着技术的发展，光散射法作为粒度测定方法收录进药典中，激光粒度仪可以给出样品详细的粒度分布信息，逐渐普及成为制药行业进行研发和生产的关键型仪器。

早期对激光粒度仪的应用，在仪器测得的粒度数据中，有些做法是只控制原料的D90或者只控制D50参数，这种做法也多见于文献报道，例如有文献研究替格瑞洛原料药粒径减小对体外溶出度的影响[1]，认为要获得与原研片生物等效的制剂，建议原料药粉末粒径分布控制在D90≤20μm。然而从前面的例子可知，如果只关注其中一个特征粒径值而忽略了其他必要的粒度信息，在质量控制上很容易出现大的风险。

我们来看一个硝苯地平缓释片剂的例子[2]。筛分法是难以区分出这几个样品的不同的，而激光粒度仪可以把样品的细微差异展示出来。
从下图的溶出曲线对比来看，随着粒径的减小，溶出速度加快。与原研药溶出行为Z相似的是粒度在适中大小的样品3。可见原研药为了控制溶出速度对粒度做了控制。因此，我们需要对粒度分布做分析，找到原研药对粒度的要求。

如果只看D90，沿袭筛分的方法思路，只需要D90小于45μm就可以。这个指标无法得到溶出行为稳定的样品。

如果只看D50，样品2和样品4的溶出行为极其相似，但是D50差异显著。样品3和样品4的D50很接近，然而溶出行为差异比较大。显然，只控制D50也不能得到溶出行为稳定的样品。

样品2、3、4溶出相似因子f2都大于50，样品3的溶出行为与对照品Z为相似达到77，我们ZD分析这3个样品的粒度。如果找到了原研药对粒度控制的思路，那么对获得一致性更好的稳定样品是很有可能的。我们把D90、D50、D10结合起来分析。从D10来看，三个样品的值比较接近，说明很小的颗粒不是影响溶出的主要因素。对比样品2和样品3，D50差异比较大，说明减少平均粒径有利于溶出，当平均粒径减少到5μm时，继续减小粒径已经没有帮助。

对比样品3和样品4，两个样品的D50比较接近，主要差异是D90，说明这时影响溶出的主要因素是较大的颗粒段，样品3中存在的较大颗粒组分是导致其与样品2相比溶出相似因子f2更高的原因。可以推测，原研药是通过控制较大颗粒的粒度分布使D50~D90分布在5~30um区间来平衡小颗粒过快的溶出速度，从而得到适宜的溶出释药。

以上的分析表明，要获得与原研药溶出相似的稳定样品，在粒度分布上可以通过D10、D50、D90三个区间值来控制粒度范围。比如本例样品需要把粒度分布控制在D10~D50分布于1~5um区间，D50~D90分布于5~30um区间。

随着激光粒度仪的普及应用，实现了对粉体粒度分布的精细化分析。越来越多的研究表明精细的粒度分布控制是保证样品与对照品具有高溶出相似度的条件。

例如有文献报道[3]，当格列美脲片原料药样品的粒度范围控制在比较窄的粒径段(0.1~5.8μm)，并且粒度曲线呈均匀分布时，制片后样品与对照品的溶出相似因子f2均达到80以上。前面的论述提到，通过特征值如D90、D50、D10可以控制粒度分布范围，这里还有一点是我们需要额外关注的，就是粒度分布曲线。对于一个粒度分布范围很窄的粉体，粒度分布曲线通常呈单分布。然而对于常规的样品而言，控制整体粒度分布曲线峰型和控制特征粒径值同样重要。两种特征粒径值差异不大但粒度分布曲线不同的样品，其溶出行为很可能会不一致，甚至对产品性能或可生产性的影响也可能会非常大。

如下图的例子，两个样品的特征粒径值差别不大，但粒度分布曲线一个是单峰正态分布另一个却是双峰分布，两者有着明显的区别。两个样品做成的制剂溶出度也会有明显差别。一些业内研究人员的实际经验也说明，不同批次的原料粒度分布差异可能非常大，除了常见的峰宽差异之外(边界特征值D10/D90的差异)，也有出现单峰变双峰这种峰型的差异。所以需要把原料的粒度分布曲线的峰型也纳入到评价标准之中。

对于粉体药物而言，粒度是它质量标准中至关重要的一环。粒度不同，其表观溶解度、溶出度和生物利用度也会有较大差异，会影响药品生产与制剂过程，进而影响药品质量。即使是同一种药物，由于粒度不同，其不仅物理性质会有所不同，而且其生物活性也有明显差异，干扰药物的临床使用。因此对药物进行研究并制定合适的控制粒度的质量标准，对于提高药物的有效性、安全性和质量稳定性具有重要的现实意义。

欧美克Topsizer激光粒度分析仪

本文通过一些例子说明了需要精细控制原料药粒径的意义——为了得到合适的溶出速率并与原研一致；以及说明了如何分析并控制粒径——需要考察特征值，使粒度分布在合适的区间内，并考察粒度分布曲线峰型的一致。

一旦确定需要控制粉体的粒度分布，下一个问题就是如何建立一个恰当的粒度标准。通过建立粒度标准，并在生产中使用，才能达到控制粉体粒度分布的要求，获得稳定的产品质量。关于如何建立粒度标准请继续关注我们的系列文章。

参考文献：

[1] 王燕,吕慧敏,等.替格瑞洛原料药粒径对其片剂体外溶出行为的影响.ZG药房,2017,28(1).

[2] 刘洁,王燕,等.硝苯地平不同粒度对其缓释片剂质量的影响.ZG药师,2018,21(6).

[3] 文君,肖亚宝,黄桂花.微粉化技术提高格列美脲片溶出度.北方药学,2013,(8).

体外一致性评价是仿制药研发的核心内容，目的在于如何达到与原研药的一致性进而提高BE试验成功率。粒度大小和分布是制剂质量Z重要的指标之一，是原研药物企业的“内控指标”，不同颗粒度的API在体内释放及吸收的速率和程度完全不同，它决定了药物的溶出速率和生物利用度等。可以说，仿制药产品如果做到了与原研产品API颗粒度一致，BE试验的成功率将大大提高。

研究粒度是要在以后的生产中控制粒度分布，以达到批间的一致性，这就要在研发时找到不同粒度分布的API对溶出的影响，并确定一个粒径范围。想要达到与原研颗粒度一致的要求首先要明确目标颗粒度，直接的方法可以通过准确测定原研药中API的颗粒度来分析。如果直接测原研药品中的API粒径有困难，则需要通过溶出曲线拟合等其他手段来筛选API的粒径分布范围。

对仿制药研发而言，颗粒粒度是一项关键质量属性之一。很多研究开始关注粒径对仿制药和原研药差异的影响。例如口服固体制剂，有文献指出，受试制剂和参比制剂在崩解后，形成的API颗粒的粒径分布不一致，是导致两者体外溶出曲线差异较大的原因之一，并且多是受试制剂粒径大于参比制剂。为了得到更好的溶出效果，文献建议国内生产企业有效降低API粒径。

早期很多文献都报道了采用微粉化技术获得更小粒径的原料药，可以大大提高难溶性药物制剂的溶出度。例如头孢地尼颗粒原料药微粉化处理后确实可以提高溶出度[1]。如下表显示微粉化颗粒在不同溶出介质中均显示出与原研的相似性。

不同溶出介质中不同粒径样品相对于原研药的溶出曲线相似性评价

随后很多研究发现，如果只是简单的进行了微粉化处理，而没有对微粉化后粉体粒度减小带来的影响做进一步分析，这显然是不够的。

例如有文献研究微粉化对盐酸小檗碱原料药制品溶出度的影响[2]，采用超微粉碎机对盐酸小檗碱进行粉碎，控制粉碎时间得到不同粒径大小的粉末。从下图可以看到溶出快慢次序为：粉碎4min＞粉碎2min＞粉碎6min＞粉碎9min＞粉碎18min＞原始粉末。说明经粉碎后的盐酸小檗碱溶出效果均比原始粉末好。但是随着粉碎时间的延长(粒径逐渐变小)，溶出速率反而变慢。由此可见如果只是为了提高溶出度，粒度也并不是越小越好。

粉碎时间及溶出率

通过微粉化处理会使得原料药的平均粒径变小，从而使得其表面积增大，溶解速率增加，能一定程度的改善药物的溶出度。微粉化技术的应用并未改变原药材的主要官能团结构，当减小的一定程度后，如果粒径太小，反而影响超微粉体的溶出效果。一方面，药物颗粒粒径较小时，对后续压片、造粒等工艺效果有影响，此时总的表面能较高，体系不稳定，粒子有团聚趋势（疏水团聚），反而有可能降低有效溶出表面积，降低溶出速率。另一方面，对于疏水药物而言，附着于粒子表面的空气会阻止水分对其表面的浸润（表面能的影响），当减小粒径时，这种作用会更明显。

欧美克Topsizer 激光粒度仪

把原料药进行粉碎处理，通过粉碎时间的控制使粉体的整体粒度减小，这是Z简单易行的，并且从上面的例子可以看到不难找到一个溶出Z快的粉碎时间参数，因此早期对原料药的粒度控制较多采用这种粗糙的办法。前面的论述有提到，很多仿制药溶出不能“等效”原研药，一个很重要的原因是未重视原料药的粒度分布，未能严格把控粉碎后的粒度分布范围，从而造成溶出不一致。而且溶出Z快并不等同于药效Z大化，不同的片剂对溶出度有不同的要求。比如下图这个例子[3]，D90分别为30um、45um、60um的三个样品，与对照品溶出Z相似的是45um这个样品。而溶出Z快的30um样品反而不是需要的。可见，粒度对溶出的影响很大，并不是简单的进行粉碎处理就可以的，应该要了解溶出合格的原料药的整体粒径分布，才能进一步指导工艺。

不同溶出介质中不同粒径样品相对于原研的溶出曲线相似性评价

药物在人体内的吸收速度常常由溶解的快慢而决定，固体制剂中的药物在被吸收前，必须经过崩解和溶解然后转为溶液的过程，如果药物不易从制剂中释放出来或药物的溶解速率极为缓慢，则该制剂中药物的吸收速度或程度就有可能存在问题，另一方面，某些药理作用剧烈，安全指数小，吸收迅速的药物如果溶出速度太快，可能产生明显的不良反应，维持药效的时间也将缩短，在这种情况下，制剂中药物的溶出速率应予以控制。所以，为避免因忽视粒度而出现的低生物利用度产品及避免因粒度控制不当带来的不安全，在原料药生产中对粒度有着严格的要求。原料药的粒度应该控制在不同的粒度段，以达到药效Z大化。

特别是对于难溶性药物来讲，其药物的粒度分布是影响药品溶出的Z重要因素。因此，需要考察何种粒度下，仿制药在体外的溶出与原研药拟合度Z高? 何种粒度下，仿制药在体内与原研药有着类似的体内性能? 因此粒度的准确测定与控制就显得尤为重要。

欧美克LS-909激光粒度仪

从上面的例子可以看出，只简单考察在特定粉碎工艺下的微粉溶出效果，没有进一步考察粒度分布信息，在质量上可能是不可控的。传统的粒度测量方法中，以过筛Z为常见，过筛的方法虽然成本低，但是难以给出具体的粒度分布情况，如果只是简单的控制原料药的粒度小于多少目的方法很多时候是无法满足一致性要求的。在仿制药体外研究中，需测定不同粒径的原料药的溶解性，考察粒径大小对溶出速率和溶出度的影响，找出能够把溶出曲线区分开的不同粒度范围。随着技术的发展，光散射法作为粒度测定方法收录进药典中，激光粒度仪可以给出样品详细的粒度分布信息，逐渐普及成为制药行业进行研发和生产的关键型仪器。

参考文献：

[1] 刘为中,李志云,查晓雁.原料药粒径对头孢地尼颗粒体外溶出行为的影响.安徽医药,2015,19(8).

[2] 何婧,韩丽,等. 微粉化对盐酸小檗碱粉体学性质和溶出度的影响.ZG实验方剂学杂志,2015,(18).

[3] Example QbD IR Tablet Module 3 Quality 3.2.P.2 Pharmaceutical Development.

据报道，在我国17万药品批文中，仿制药批文占比高达95％。但我国仿制药质量良莠不齐，仿制药市场大而不强，相比于进口药依旧缺乏竞争力。

为了从源头去控制仿制药质量，淘汰内在质量和临床LX达不到要求的品种，有效提高仿制药质量水平，国家全面推进了仿制药一致性评价工作，扩大仿制药市场规模，保障药品安全性和有效性，促进医药产业升级和结构调整，增强国际竞争能力。

“一致性”是指仿制药与原研药（或“参比制剂”）的ZL等效。“ZL等效”又包含了两层含义，一是药学等效，是指同样的剂型要包含同样量的原料药，并符合同样的或法定的质量标准；另一个是生物等效，是指具有同样的临床有效和安全性。仿制药申请又称为“简化新药申请”，通过简单的PE/BE 试验，从而免去大规模临床试验，Z终实现可替换性。在开展一致性评价过程中，药品生产企业须以参比制剂为对照，全面深入地开展比对研究：包括、质量标准、晶型、粒度和杂质等主要药学指标比较研究，以及固体制剂溶出曲线的比较研究，以提高体内生物等效性试验的成功率，并为将药品特征溶出曲线列入相应的质量标准提供依据。
由于药物的溶出直接影响药物在体内的吸收和利用, 溶出度试验已成为评价制剂质量及生产工艺的指标之一。过去认为只有难溶性药物才有溶出度的问题，但近年来研究证明，易溶性药物也会因制剂的配方和工艺不同而致药物溶出度有很大差异，从而影响药物生物利用度和LX，在USP中规定测定溶出度的制剂有相当数量是易溶性药物。溶出度试验是药物一致性评价的核心内容之一，药物的颗粒度对药物的溶出性能也起着决定作用，颗粒度对于药物的质量有着直接的影响,。本文主要关注粒度分析方面的问题。

测试范围：0.01-3600μm（湿法），0.1-3600μm（干法）

重复性：≤0.5%（标样D50偏差）

准确性：≤0.6%（标样D50偏差）

粒度的重要性

之前国内对粒度问题不太重视，除了在研制高生物利用度制剂时，把减少粒度作为一种可以考虑的提高生物利用度的制剂学手段外，几乎没有在全新化合物的新药研究中考虑过粒度的问题，在仿制化合物的新药研究中亦仅有少部分考虑到粒度的问题，而粒度与安全性的问题也是少人问津。

在开展一致性评价工作后，CFDA发布的仿制药一致性评价技术指南中明确指出，粒度与粒度分布是原料药的关键理化特性，需在药学评价中进行分析检测。

测试范围：0.02-2100μm（湿法），0.1-2100μm（干法）

重复性：≤0.5%（标样D50偏差）

一致性评价工作促进了科学研发。在制药行业中，粒度控制的重要性已经是业内共识。粉体的颗粒特性已成为口服固体制剂产品开发和质量控制中至关重要的因素之一。原料药的粒度分布（Particle Size Distribution，PSD），可能会对Z终产品的性能产生显著的影响（如：溶解性、生物利用度、含量均匀度、稳定性等）。此外，原料药和辅料的粒度分布也会影响药物的可生产性（如：流动性、总混均匀度、可压性等），Z终可能影响药物的安全性、有效性和质量。

有文献报道[1]，对市面上有临床LX差异的某注射用粉末制剂仿制药与原研药的粒度研究表明，原研药不同生产批次间粒度分布稳定，仿制药不同批次间差异较大。仿制药中值粒径D50比原研药大得多，两者存在明显差异。表现在溶出时间方面，仿制药的溶出时间比原研药长得多，两者亦存在显著差异。文献认为粒度分布是原研药在生产过程中质量内控的关键指标之一，是“隐含性指标”。

很多出版物中都提到，粉体的粒度分布对口服固体制剂生产过程中的每一步都有很大影响，包括预混合/混合、制粒、干燥、整粒、包衣、包装和压片。因此，在每个特定药物申报的不同开发阶段，应评估药物生产过程中粉体的粒度影响。一旦在Z终开发阶段确定了粒度的影响，就可以选择粉体的粒度分布，并确定合适的质量标准，达到控制产品质量的目的，保证生产的一致性。

参考文献：

[1] 盖荣银,谢沐风,等.注射用粉末剂型仿制药一致性评价关键技术要点解析.ZG医药工业杂志, 2019, 50(2).

在任何药物研发进程中，实验方法的设计和优化对新药研发的成功性而言至关重要。我们需要考虑的因素包括：选择Z合适的检测技术，读取模式，和实验模型（生物化学，细胞或动物）。通常，这些因素会影响数据质量，生物相关性以及ZL的可预测性，Z终将影响整个临床前药物开发工作的成败。

方法技术的选择

diyi步是确立解决实验问题的技术，例如激活，YZ或调控靶标、阐明MOA（作用机制）、确定受体 - 配体或蛋白质 - 蛋白质的相互作用、鉴定和定量疾病特异性生物标志物或血浆中的生物标志物成分。

样本基质的兼容性

生物标志物测定旨在检测或定量生物学中的靶标样本(例如，复杂基质）中的含量，这种负责基质涵盖范围有：细胞培养中的分泌蛋白，细胞裂解液，组织提取物，唾液，尿液，血清，血浆，血液的上清液，或其他液体（例如，CSF，BALF）。分析技术可能并非总是如此。某些实验方法在某些基质中存在干扰而不适用。例如，在血清，血浆或血液中的血红蛋白表现出广泛的可见光谱吸光度，即在350和600nm之间。检测方法中，依赖于这些波长的激发或发射将容易发生干扰。基于洗涤的检测方法可以避免由于过多复杂基质引起的干扰，因为干扰物质在洗涤过程中被冲走。为了确定基质的相容性，在合适的稀释液中的加标回收和标准曲线是传统的验证方法。

同时，在复杂体系中的抗体选择也是非常重要的，靶标蛋白可能被修饰或者酶切，影响抗原识别位点，因此，加入蛋白酶YZ剂也是有必要的。

实验效果 ：灵敏度和动态范围

 一个实验的灵敏度决定了其在动态范围内的对其靶点的检测的“分辨率”，同时预警了不同批次批次之间的Z低检测范围的差异性。灵敏度同时也依赖于检测样本。血清中的检测难度高于细胞水平。同时“珍贵样品”如有限的细胞或者组织会决定测试的容许体积等。方法技术也会影响检测灵敏度，如发光和荧光的模式比吸收光的模式的灵敏度要好。

动态范围定义了检测下限和上限。例如下图所示，不同的检测技术对于肿瘤坏死因子TNF的检测动态范围达到了数量级的差异。因此，当样品含量超过了其实验方法的动态范围，其浓度，动力学参数，活性，结合力将不准确。因此，需要预先滴定检测窗口以免达到饱和。

下图展示了不同实验技术对于不同的亲和力的适用范围：

特异性

特异性对于确保筛选靶向的靶点或表型非常重要。对于免疫分析，需要考虑针对靶向分析物特异性的抗体，特别是对于靶向蛋白质的部分修饰新表位变化,结合/未结合或活性/非活性状态。此外，还需要考虑物种和靶点的交叉反应性。

稳定性和准确性

尽管信号强度和和性噪比（S/B）通常被用来评估一个实验的质量，可重复性和准确性也是非常重要的。Z’是一个非常好的评判标准。例如，相对而言，高Z’而低信噪比的实验方法好于低Z’高性噪比的实验方法。与此同时，实验发法应当具有高重复性，定量实验应该有标准品做参照。设置好对照，好的标品，抗体，阳性化合物对于建立可靠的实验是非常重要的。

试剂和其他耗材

对于免疫实验来说，高灵敏度和搞特异性的抗体非常重要，同时还有对应的酶或重组蛋白。通常，所有的实验成分，例如细胞、蛋白、酶、辅因子、底物、激动剂，拮抗剂等都需要进行浓度滴定以确定Z优浓度。该过程能够确保稳定的动力学研究以及防止过饱和浓度而产生的试剂浪费。（如下图）

细胞模型

在选择细胞模型时，应考虑使用原代细胞与重组/永生化细胞系的优缺点，以及研究内源性与重组表达的靶蛋白。同时需要评估目标蛋白的表达水平，因为过多或过少的表达会影响灵敏度和分析质量。细胞传代和培养条件也会影响实验质量。

微孔板的选择

正确选择微孔板可以减少交叉效应、降低背景、降低信号吸收或放大信号强度。下表显示了基于检测方法的微孔板选择矩阵。

众所周知，药物研发花费巨大，耗时长。优化已知影响数据质量、生物相关性和ZL可预测性的实验因素Z终推动整个临床前药物开发工作的成功。选择Z合适的分析技术、读取模式和实验模型以及优化实验方案为成功和经济有效的药物开发奠定基础。

我们珀金埃尔默能够提供多种实验方法开发的解决方案。例如，我们拥有的均相的Alpha技术以及TRFRET技术，时间分辨defia技术，化学发光技术，细胞增殖和毒性试剂盒，各类GPCR以及动物模型的探针细胞株，微孔板等试剂耗材，能够助力您新药研发的各个环节。

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关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

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目前ZG创新药面临前所未有的大机遇，又面临无数的困难和各种挑战。随着国家在生物医药研究领域的投入越来越大，基础研究文章日渐高产，但真正可供转化的原创研究凤毛麟角，在目前的这种形势下如何突出重围、实现药物的差异化研究就显得尤其重要。

此次Science Corner活动Vπ张江药谷平台与珀金埃尔默公司联合举办药物开发方法与技术研讨会，有幸邀请到ZG科学院上海药物研究所研究员、博士生导师、课题组长杨春皓先生，与大家探讨绍药物差异化研究的可能途径，并结合课题组的研究工作展开介绍。同时，珀金埃尔默公司应用解决方案事业部的专家将为大家分享药物研发的相关解决方案。

诚挚邀请您参加此次研讨会，与专家一起共同探讨药物开发的方法与技术！

会议详情

直播时间

2020年6月18日14:00-16:00

讲座题目

14:00-15:00

小分子药物差异化研究策略探讨

15:00-15:30

单细胞ICP-MS技术在药物研发中的应用

15:30-16:00

联机技术在药物研发中的应用

讲师介绍

杨春皓

ZG科学院上海药物研究所研究员

博士生导师 课题组长

马晓玲

珀金埃尔默

ZS应用科学家

华诚

珀金埃尔默

ZG中区技术支持区域经理

观看方式

扫描下方二维码，马上预约直播席位：

医药行业美好而竞争激烈，而生物药的发展在行业中越来越得到各大制药公司的重视。而好的稳定细胞株适用于药物研发的各个阶段，如重组蛋白和抗体生产、检测分析、功能性研究等等。通过稳定细胞株高产量蛋白，可进一步进行体外生物活性研究，通过体外的生物活性研究可推测在体内的活性情况，指导药物的研发，并为后期临床试验提供参考。为了帮助大家学习和掌握稳定细胞株构建的技术，提高细胞株开发效率并指导如何进行生物活性验证，Molecular Devices 联合生物制品圈将于 2020 年 9 月 23 日 19：00-21：00 时举办ZT在线分享，详细信息如下：

讲座日程

报名方式

扫描下方二维码，登记信息即可在直播前获取地址，名额有限，报名从速。请报名的各位老师提前准备好问题，通过发文字形式向嘉宾提问，演讲嘉宾将按提问的先后顺序选择回答。

主讲专家

李浩强 皓阳生物联合创始人、总经理

10 年抗体或重组蛋白药物研发经验，ZG药科大学硕士，长期从事高表达稳定细胞株构建和细胞培养工艺开发，曾深度参与了某知名 CDMO 公司细胞株构建平台的建立和完善，负责十余个国内外项目，参与培养基的引进、开发和优化，负责双特异性抗体项目的细胞株构建工作。在皓阳建立了基于 DG44 和 CHOK1 的稳定细胞株开发平台，将细胞株构建的时间缩短到 10 周，同时提高表达量到 4-8g。指导培养基的自主开发，大幅降低了客户的生产成本。

主题摘要：稳定细胞株构建是生物药物开发的重要组成部分，一个好的细胞株能够大大缩短药物开发周期，减少工艺开发的困难，降低工艺放大的风险，本讲座将整体描述高表达稳定细胞株构建的流程和方法，为相关工作的开展带来借鉴和启示。

崔灵英  上海甲贝生物医药技术有限公司任职 QC 副总监

负责早期药物研发、放行及 IND 申报的质量控制。从事抗体药物研发、生物活性分析和质量控制方面 10 年以上工作经验，曾先后在康弘、上海嘉和、凯慧睿智生物负责分析工作。

主题摘要：生物活性方法从早期靶点验证、药物发现和开发、放行、IND 申报到临床研究及药物上市都离不开体外活性的检测，不同阶段对活性方法的要求也不一样，但是活性方法一定是反应药物的作用机制。基于作用机制建立的方法，通过验证后，能相对准确反应药物在体内的活性情况，指导药物研发与生产，为临床提供数据支持。

徐孟杰  Molecular Devices 公司市场部技术主管

毕业于中科院上海生命科学研究院，从事生物制药、蛋白质分析相关工作近 10 年，熟悉生物制药领域相关技术和产品，主要负责ZG区生物制品开发产品线的技术支持工作。

主题摘要：GX建立稳定细胞株并符合法规要求是研究人员追求的目标。基于微流控芯片技术和智能图像分析技术的 CloneSelect 高通量单细胞分离系统，可以GX地分离单个活细胞至微孔板，ZZ获得克隆数目是有限稀释的 4 倍以上。记录单细胞分离的时间序列图像可以进一步加强单克隆性的可信度。一次性的分离槽省却清洗验证步骤，使得操作更加简洁方便。这些优异特征都有助于提高细胞株开发的效率。

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       寻求改进质量和提GX率的药品生产商对使用 Sievers*总有机碳（TOC）分析仪进行清洁验证的兴趣越来越浓。大多数制药或生物科技厂家目前都配有 TOC 分析仪以符合美国药典USP、ZG药典 ChP的水检测要求，以放行纯化水或注射用水用于清洁或生产过程。因此，大多数厂家已经拥有用于清洁验证的TOC测定方法。 

       TOC 是 FDA 认可的一种方法¹，用于评估所给样品中 所有含碳的化合物，以确保所有设备 的清洁都符合所建立的清洁标准。TOC分析允许开发一种方法， 用于检测由化合物、分析物或残留物通过直接（擦 拭）或间接（冲洗）取样而形成的碳浓度。潜在目 标残留物包括药物活性成分（API）、药品赋形剂、 蛋白质、蛋白质副产品和清洁剂或成分。 

       1996年，国际协调会议（ICH）在FDA（CDER &  CBER²）的协助下，创建了指导文件《Q2B；分析 步骤的验证》。本文档的目的是为制药公司提供指导，以考虑用于清洁验证的分析方法验证中的具体特征。此应用说明提供了与下列参数相关的多个实例，这些实例均与 TOC 方法验证有关，因而此应用说明呼应了Q2B指导文件： 

• 检出限和定量限 

• 确定分析物的准确度和精确度 

• 线性和回收百分比验证 

• 分析方法的稳固性³

检出限和定量限 

       ^{检出限（LOD）用于评估何时信号是仪器噪音的结果还是化合物的反应。LOD被视为样本中分析物的 Z低检测量，但没有必要的足够的统计确定性来定量。定量限（LOQ）是对数据有意义还是无意义提供指 导而建立的值。}

       低于 LOQ 的仪器反应表示存在有机物，但无法定量实际浓度。分析仪中的读数高于已建立的 LOQ 则被视为可定量或有意义的数据。

       为了确定背景 TOC 的浓度并推导出用于清洁验证方案的 LOD 和 LOQ，必须准备低 TOC 的水空白或棉签空白（如果适用）来计算实验中水和小瓶的碳成分。 一旦已经从这些样本中确定了标准偏差，则通常是将标准偏差分别乘以3和10来获得 LOD 和 LOQ⁴。

确定分析物的准确度和精确度 

       了解 TOC 分析方法验证中准确度和精确度的区别非常重要。准确度与测得值和分析物的真实值的接近 程度相关。通常，准确度是计算仪器验证时测得的标准品的 TOC 浓度与预期的标准品 TOC 浓度的差值百分比（即+7%）所得。 

       精确度通过标准偏差或 RSD（变异系数）度量。精确度与所给样本的多个分析结果相互之间的接近程 度相关。 

       在 TOC 方法验证期间，通过分析加了（添加）已知 浓度的目标残留物的样品可以测定准确度和精确度， 并可以评定差值百分比和 RSD。ICH 文件推荐至少在三个浓度级别上至少进行九次测定来评估准确度 和精确度，这三个浓度级别涵盖了仪器的指定范围 ⁵。

线性和回收百分比验证 

       通常，线性测试校验仪器反应值是否与所研究分析 物的浓度具有线性关系。图1演示了TOC浓度范围 从 1.00 ppm到 7.50 ppm，牛血清白蛋白（BSA）的 线性关系，其中含低TOC水的小瓶中加了已知浓度 的 BSA 。这个例子演示了理论浓度（x轴）对所测得的浓度（y轴）作图所得到的两者之间的线性关系，y=(m)x+b。分析仪的反应值与所研究化合物的相关系数（R2）应大于0.97。

       为了确定TOC方法用于分析目标残留物的适用性， 有必要确定分析方法可达到的回收率。以下例子使用 CIP-100 制备已知 TOC 度的溶液，并将已知量的样本放到不锈钢片上，演示了直接取样方法。在BSA的例子中，在不锈钢片上添加三个递增浓度的 CIP-100 清洁液，擦拭不锈钢片，然后将此棉签放到已知量的低TOC水中。表 1 提供了从不锈钢片表面获得的回收百分比结果。

分析方法的稳固性 

       与实际回收率同样重要的是，用于确定所研究化合物回收百分比的 TOC 分析方法的重现性或稳健性。 在清洁验证方法开发中稳固性是指结果不受方法中参数、或样本之间的小而微妙的变化的影响的能力。 还提供了正常使用期间的可靠性指示（例如各个分 析员的取样方法）。若希望得到高回收率，回收率一直保持可重复性也同等重要或更为重要，并在整 个方法开发期间一直需要对回收率进行检测。表 1 和表 2 提供了CIP-100 棉签回收率分析信息，由两个不同的分析员测试样本间的变化。

要考虑的Z后几点

评估制药产品质量水平的测试步骤要遵从各项要求。具体到清洁验证来说，当前的药品生产质量管理规范［21 CFR 211.194(a)] 要求，用于评估药品是否符合已建立规范的测试方法必须满足准确度和可靠性的合适标准7。同时考虑到分析方法的验证是通过实验室研究建立的过程，本应用说明中说明的（TOC）方法的性能特征满足计划进行的分析应用的某些要求，例如符合药典的水排放和清洁验证。

参考文献

1. FDA网站：www.fda.gov/cder/guidance/cGMPs/equipmenthtm。

2. 药品评估与研究ZX（CDER）和生物制品评估和研究ZX（CBER)。

3. Guidance for industry Q2B: Validation of Analytical Procedures. Methodology. November 1996. ICH, FDA, CDER, CBER. 

4. Taylor, John K. Quality Assurance of Chemical Measurements. Lewis Publishers imprint of CRC Press; 1987. 

5. USP <1225> Validation of Compendial Methods.. 

6. The Swab Recovery Determination of CIP-100 in Solutions by TOC Analysis Using a Sievers TOC Analyzer, Steris Corporation Analytical Method; 1993. 7. 21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

7. 21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.