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各位奋斗在方法验证战线的小伙伴们，你是否困扰于分析方法验证实验？首先要起草验证方案，做完实验后，还有一系列的计算、汇总、报告……计算过程繁琐耗时，汇总报告数据繁多……

如果您有此困扰，不妨来看看沃特世Empower MVM方法验证插件解决方案。Empower 3方法验证管理器（MVM）是Empower 3色谱数据软件的选件，让您可以在同一个应用程序内完成整个色谱方法验证过程，从最初的规划方案到最 后的报告结果。

划重 点

Empower 3 MVM能为实验室和企业带来一系列的优势，包括：

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• 更易于符合法规要求，与此同时显著增强数据可追溯性。

• 方法验证时无需使用不同的软件。

• 自动化地、更有效率地简化方法验证工作流程。

• 轻松地确认数据是否符合方法验证要求，结果是否在规定范围内

• 验证数据安全地存储在数据库内。

MVM方法验证管理器使用流程

下面，就让我们一起来看看Empower MVM是如何帮助您自动完成方法验证的吧:

第 一步，创建MVM验证方案模板，并设置每个验证工作的限度标准。我们以线性测试为例，需要设置线性样品包含几个浓度水平，每个浓度配几份样品，每个样品进样次数，以及对于线性R2的限度要求等。

第二步，创建样品组，并勾选每针进样所属的验证测试工作。

第三步，运行样品，得到色谱结果。

第四步，得到验证结果。Empower会自动进行计算，并与限度比较，得到是否满足验证要求的结论。

第五步，查看并生成验证报告。

验证报告可通过统计图和数据表格的形式报告，验证结果通过与否一目了然，还可以根据需求自定义报告模版，满足不同验证要求。

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       寻求改进质量和提GX率的药品生产商对使用 Sievers*总有机碳（TOC）分析仪进行清洁验证的兴趣越来越浓。大多数制药或生物科技厂家目前都配有 TOC 分析仪以符合美国药典USP、ZG药典 ChP的水检测要求，以放行纯化水或注射用水用于清洁或生产过程。因此，大多数厂家已经拥有用于清洁验证的TOC测定方法。 

       TOC 是 FDA 认可的一种方法¹，用于评估所给样品中 所有含碳的化合物，以确保所有设备 的清洁都符合所建立的清洁标准。TOC分析允许开发一种方法， 用于检测由化合物、分析物或残留物通过直接（擦 拭）或间接（冲洗）取样而形成的碳浓度。潜在目 标残留物包括药物活性成分（API）、药品赋形剂、 蛋白质、蛋白质副产品和清洁剂或成分。 

       1996年，国际协调会议（ICH）在FDA（CDER &  CBER²）的协助下，创建了指导文件《Q2B；分析 步骤的验证》。本文档的目的是为制药公司提供指导，以考虑用于清洁验证的分析方法验证中的具体特征。此应用说明提供了与下列参数相关的多个实例，这些实例均与 TOC 方法验证有关，因而此应用说明呼应了Q2B指导文件： 

• 检出限和定量限 

• 确定分析物的准确度和精确度 

• 线性和回收百分比验证 

• 分析方法的稳固性³

检出限和定量限 

       ^{检出限（LOD）用于评估何时信号是仪器噪音的结果还是化合物的反应。LOD被视为样本中分析物的 Z低检测量，但没有必要的足够的统计确定性来定量。定量限（LOQ）是对数据有意义还是无意义提供指 导而建立的值。}

       低于 LOQ 的仪器反应表示存在有机物，但无法定量实际浓度。分析仪中的读数高于已建立的 LOQ 则被视为可定量或有意义的数据。

       为了确定背景 TOC 的浓度并推导出用于清洁验证方案的 LOD 和 LOQ，必须准备低 TOC 的水空白或棉签空白（如果适用）来计算实验中水和小瓶的碳成分。 一旦已经从这些样本中确定了标准偏差，则通常是将标准偏差分别乘以3和10来获得 LOD 和 LOQ⁴。

确定分析物的准确度和精确度 

       了解 TOC 分析方法验证中准确度和精确度的区别非常重要。准确度与测得值和分析物的真实值的接近 程度相关。通常，准确度是计算仪器验证时测得的标准品的 TOC 浓度与预期的标准品 TOC 浓度的差值百分比（即+7%）所得。 

       精确度通过标准偏差或 RSD（变异系数）度量。精确度与所给样本的多个分析结果相互之间的接近程 度相关。 

       在 TOC 方法验证期间，通过分析加了（添加）已知 浓度的目标残留物的样品可以测定准确度和精确度， 并可以评定差值百分比和 RSD。ICH 文件推荐至少在三个浓度级别上至少进行九次测定来评估准确度 和精确度，这三个浓度级别涵盖了仪器的指定范围 ⁵。

线性和回收百分比验证 

       通常，线性测试校验仪器反应值是否与所研究分析 物的浓度具有线性关系。图1演示了TOC浓度范围 从 1.00 ppm到 7.50 ppm，牛血清白蛋白（BSA）的 线性关系，其中含低TOC水的小瓶中加了已知浓度 的 BSA 。这个例子演示了理论浓度（x轴）对所测得的浓度（y轴）作图所得到的两者之间的线性关系，y=(m)x+b。分析仪的反应值与所研究化合物的相关系数（R2）应大于0.97。

       为了确定TOC方法用于分析目标残留物的适用性， 有必要确定分析方法可达到的回收率。以下例子使用 CIP-100 制备已知 TOC 度的溶液，并将已知量的样本放到不锈钢片上，演示了直接取样方法。在BSA的例子中，在不锈钢片上添加三个递增浓度的 CIP-100 清洁液，擦拭不锈钢片，然后将此棉签放到已知量的低TOC水中。表 1 提供了从不锈钢片表面获得的回收百分比结果。

分析方法的稳固性 

       与实际回收率同样重要的是，用于确定所研究化合物回收百分比的 TOC 分析方法的重现性或稳健性。 在清洁验证方法开发中稳固性是指结果不受方法中参数、或样本之间的小而微妙的变化的影响的能力。 还提供了正常使用期间的可靠性指示（例如各个分 析员的取样方法）。若希望得到高回收率，回收率一直保持可重复性也同等重要或更为重要，并在整 个方法开发期间一直需要对回收率进行检测。表 1 和表 2 提供了CIP-100 棉签回收率分析信息，由两个不同的分析员测试样本间的变化。

要考虑的Z后几点

评估制药产品质量水平的测试步骤要遵从各项要求。具体到清洁验证来说，当前的药品生产质量管理规范［21 CFR 211.194(a)] 要求，用于评估药品是否符合已建立规范的测试方法必须满足准确度和可靠性的合适标准7。同时考虑到分析方法的验证是通过实验室研究建立的过程，本应用说明中说明的（TOC）方法的性能特征满足计划进行的分析应用的某些要求，例如符合药典的水排放和清洁验证。

参考文献

1. FDA网站：www.fda.gov/cder/guidance/cGMPs/equipmenthtm。

2. 药品评估与研究ZX（CDER）和生物制品评估和研究ZX（CBER)。

3. Guidance for industry Q2B: Validation of Analytical Procedures. Methodology. November 1996. ICH, FDA, CDER, CBER. 

4. Taylor, John K. Quality Assurance of Chemical Measurements. Lewis Publishers imprint of CRC Press; 1987. 

5. USP <1225> Validation of Compendial Methods.. 

6. The Swab Recovery Determination of CIP-100 in Solutions by TOC Analysis Using a Sievers TOC Analyzer, Steris Corporation Analytical Method; 1993. 7. 21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

7. 21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

寻求改进质量和提GX率的药品生产商对使用Sievers®总有机碳（TOC）分析仪进行清洁验证的兴趣越来越浓。大多数制药或生物科技厂家目前都配有TOC分析仪以符合美国药典USP、ZG药典ChP的水检测要求，以放行纯化水或注射用水用于清洁或生产过程。因此，大多数厂家已经拥有用于清洁验证的TOC测定方法。

TOC是FDA认可的一种方法➀，用于评估所给样品中所有含碳的化合物，以确保所有设备的清洁都符合所建立的清洁标准。TOC分析允许开发一种方法，用于检测由化合物、分析物或残留物通过直接（擦拭）或间接（冲洗）取样而形成的碳浓度。潜在目标残留物包括药物活性成分（API）、药品赋形剂、蛋白质、蛋白质副产品和清洁剂或成分。

1996年，国际协调会议（ICH）在FDA（CDER & CBER➁）的协助下，创建了指导文件《Q2B：分析步骤的验证》。本文档的目的是为制药公司提供指导，以考虑用于清洁验证的分析方法验证中的具体特征。此应用说明提供了与下列参数相关的多个实例，这些实例均与TOC方法验证有关，因而此应用说明呼应了Q2B指导文件：

■ 检出限和定量限

■ 确定分析物的准确度和精确度

■ 线性和回收百分比

■ 分析方法的稳固性➂

检出限和定量限

检出限（LOD）用于评估何时信号是仪器噪音的结果还是化合物的反应。LOD被视为样本中分析物的ZD检测量，但没有必要的足够的统计确定性来定量。

定量限（LOQ）是对数据有意义还是无意义提供指导而建立的值。低于LOQ的仪器反应表示存在有机物，但无法定量实际浓度。分析仪中的读数高于已建立的LOQ则被视为可定量或有意义的数据。

为了确定背景TOC的浓度并推导出用于清洁验证方案的LOD和LOQ，必须准备低TOC的水空白或棉签空白（如果适用）来计算实验中水和小瓶的碳成分。一旦已经从这些样本中确定了标准偏差，则通常是将标准偏差分别乘以3和10来获得LOD和LOQ➃。

确定分析物的准确度和精确度

了解TOC分析方法验证中准确度和精确度的区别非常重要。准确度与测得值和分析物的真实值的接近程度相关。通常，准确度是计算仪器验证时测得的标准品的TOC浓度与预期的标准品TOC浓度的差值百分比（即+7%）所得。

精确度通过标准偏差或RSD（相对标准偏差）度量。精确度与所给样本的多个分析结果相互之间的接近程度相关。

在TOC方法验证期间，通过分析加了（添加）已知浓度的目标残留物的样品可以测定准确度和精确度，并可以评定差值百分比和RSD。ICH文件推荐至少在三个浓度级别上至少进行九次测定来评估准确度和精确度，这三个浓度级别涵盖了仪器的指定范围➄。

线性和回收百分比验证

通常，线性测试校验仪器反应值是否与所研究分析物的浓度具有线性关系。图1演示了TOC浓度范围从1.00ppm到7.50ppm，牛血清白蛋白（BSA）的线性关系，其中含低TOC水的小瓶中加了已知浓度的BSA。这个例子演示了理论浓度（x轴）对所测得的浓度（y轴）作图所得到的两者之间的线性关系，y=(m)x+b。分析仪的反应值与所研究化合物的相关系数（R2）应大于0.97。

为了确定TOC方法用于分析目标残留物的适用性，有必要确定分析方法可达到的回收率。以下例子使用CIP-100制备已知TOC度的溶液，并将已知量的样本放到不锈钢片上，演示了直接取样方法。在BSA的例子中，在不锈钢片上添加三个递增浓度的CIP-100清洁液，擦拭不锈钢片，然后将此棉签放到已知量的低TOC水中。表1提供了从不锈钢片表面获得的回收百分比结果。

分析方法的稳固性

与实际回收率同样重要的是，用于确定所研究化合物回收百分比的TOC分析方法的重现性或稳健性。在清洁验证方法开发中稳固性是指结果不受方法中参数、或样本之间的小而微妙的变化的影响的能力。还提供了正常使用期间的可靠性指示（例如各个分析员的取样方法）。若希望得到高回收率，回收率一直保持可重复性也同等重要或更为重要，并在整个方法开发期间一直需要对回收率进行检测。表1和表2提供了CIP-100棉签回收率分析信息，由两个不同的分析员测试样本间的变化。

要考虑的ZH几点

评估制药产品质量水平的测试步骤要遵从各项要求。具体到清洁验证来说，当前的药品生产质量管理规范［21 CFR 211.194(a)] 要求，用于评估药品是否符合已建立规范的测试方法必须满足准确度和可靠性的合适标准➆。

同时考虑到分析方法的验证是通过实验室研究建立的过程，本应用说明中说明的（TOC）方法的性能特征满足计划进行的分析应用的某些要求，例如符合药典的水排放和清洁验证。

参考文献

➀.FDA网站：www.fda.gov/cder/guidance/cGMPs/equipmenthtm。

➁.药品评估与研究ZX（CDER）和生物制品评估和研究ZX（CBER)。

➂.Guidance for industry Q2B: Validation of Analytical Procedures. Methodology. November 1996. ICH, FDA, CDER, CBER.

➃.Taylor, John K. Quality Assurance of Chemical Measurements. Lewis Publishers imprint of CRC Press; 1987.

➄.USP <1225> Validation of Compendial Methods..

➅.The Swab Recovery Determination of CIP-100 in Solutions by TOC Analysis Using a Sievers TOC Analyzer, Steris Corporation Analytical Method; 1993. 7. 21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

➆.21 CFR 211.194(a) Laboratory Records.

       颗粒学研究包罗万象，嫁接到不同领域成果斐然。其中生物制药向的颗粒学研究；与环境、健康息息相关的气溶胶研究；不断向“小”进军的超微及纳米颗粒研究；以及颗粒检测与表征新技术研发都是近年来颗粒学研究应用的热区之一。特别在疫情之下的2020，更成为社会舆论关注的焦点。

      基于此，4月9日-4月10日，行业网站与ZG颗粒学会联合主办首届“颗粒研究应用与检测分析”主题网络大会。分设生物制药颗粒、气溶胶、超微及纳米颗粒、颗粒检测与表征四个分会场，邀请21位享誉业内，从事颗粒学从事颗粒学研究的学术大咖剖析、讲解颗粒学研究应用及检测分析的前沿热点和疑难杂症。

珠海真理光学仪器有限公司很荣幸被邀请在生物制药颗粒专场做报告“药物粒度分析的方法开发与验证”。

        报告人：秦和义，珠海真理光学仪器有限公司商务总经理， ZG颗粒学会理事会理事、全国颗粒表征与分检标准化技术委员会颗粒分技术委员会委员、ZG颗粒测试专业委员会及学术委员会委员 。从事颗粒表征和粒度分析工作25年，曾任英国马尔文仪器ZG技术与应用经理及ZG区总经理、英国富瑞曼科技有限公司ZG首席代表，在颗粒粒度测试技术和应用领域具有丰富经验和认知。

        报告摘要：药物颗粒的粒度分布直接影响药物的释放和生物利用度，由于药品质量控制的特殊性和高要求，所有药物粒度的分析仪器性能和测试方法都需要确认和验证，以保证测试结果的一致性和重现性。本报告从应用角度阐述粒度分析仪器性能认证的意义并探讨药物粒度分析方法开发和验证的要素及步骤。

      直播报告气氛热烈，引起大家的热烈讨论和关注。【真理光学】将继续在颗粒表征领域发光发热，贡献力量。

动态光散射 (DLS) 正在成为制药行业中越来越流行的亚微米级药品粒度分析技术。本技术说明试图为使用此技术进行方法开发和验证放行测试的客户提供指导。

1、方法验证

分析方法验证是证明分析程序适合其预期目的的过程5。并非所有验证特征都适用于粒度分析。较早的 FDA 工业指南（非实施）草案文7包括一个专门针对粒度分析的部分。尽管较新的已发布文件取代了较旧的指南草案，但有关粒度分析的较旧部分提供了有关粒度分析与其他技术（如 HPLC）的不同之处的见解。旧文档中的以下声明有助于方法验证工作：

“方法验证通常涉及中间精度和重复性的评估。应保证生成的数据是可重复的，并控制产品的质量。”7

考虑到这一评论，下面提供了解决 DLS 方法验证的建议

● 特异性：N/A，DLS 检测大小变化但对不同化学物质不敏感。

● 线性：N/A，DLS 没有任何线性关系。

● 准确性：N/A，仪器的准确性使用标准粒子进行验证，但缺乏公认的定量裁判方法（SEM/TEM 显微镜）不包括准确性确定。包括样品的 SEM/TEM 图像以支持方法验证可能是更合适的。

● 精密度（重复性、中间精密度和重现性）：这是需要重 点关注的地方。通常这些术语的定义在粒度分析领域可能不同于其他技术。以下评论来自粒度分析领域：

     重复性：多次测量样品。

     重现性：准备样品、测量、丢弃、清洁、重复。建议的方法是制备五份样品，然后对每个样品进行五次分析。

     中间精密度：此活动涉及第二位分析员、第二台仪器或两者兼而有之。如果所有测试都在一个地点进行，则由同一系统上的不同操作员在不同日期分析同一批次的样品。如果要在多个地点进行测试，则同一样本（或批次）由不同操作员在不同地点的不同系统上进行分析。

● 范围：N/A，仅在所用系统的工作范围内工作。无需对此进行测试或记录。

● 定量限：N/A，这只是测试粒径。

● 检测限：N/A，方法开发应确保样品在系统检测限内。

一旦一种方法得到验证，该程序就应该用于产品的生命周期。如果需要重复调整，则应重新评估和重新验证该方法。

2、结构示例

两名操作员在两个 Nicomp DLS 系统上分析了一种药物物质（异丙酚乳剂）。该样品已过期，但仍显示符合 USP <729> 的合格结果。仪器设置如下：

Instrument A：

Instrument B：

3、方法开发

首先分析 92 nm PSL 标准以确保适当的系统性能。测量结果在预期值的 98% 以内。建议在开始此类工作之前进行此验证测试。

接下来进行快速研究以测试浓度（稀释）的影响。参见图 1 中的结果。

将 10 滴样品加入 15 mL 去离子水中并进行分析。重复相同的制备。然后将这些样品按 2:1 稀释并进行分析。样品看起来太浑浊，结果发生变化，因此将下一滴添加到 15 mL DI 水中。样品出现轻微混浊，这些结果是可以接受的。有时，稀盐溶液是比纯去离子水更好的稀释剂。下一步是将一滴样品加入 10 mL 过滤后的 10 mM KCl 溶液中。这些结果似乎更好，因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他测量。

在进行稀释研究时，分析时间也从3分钟到10分钟不等。三分钟、五分钟和十分钟分析时间的时间曲线图如图2-4所示。红色=光强粒径平均值，蓝色=体积粒径平均值，蓝色=数量粒径平均值。

该方法选择了5分钟的分析时间。在五分钟的分析时间完成之前，光强平均粒径结果已经稳定下来。但直到大约9分钟前，体积和数量加权平均结果仍在变化。这是也是在使用DLS时仅选择光强粒径结果的一个原因。这可能是方法开发中测试重复性很好的一个点。在这种情况下，也许下一个测试的分析时间是四分半、五分和五分半钟。在这项研究中没有执行这一步骤，值得指出的是，整个方法开发和验证研究在不到8个小时内完成。更严格的最 终发布测试方法开发和验证方法很可能需要至少几天时间。

4、样品准备

——在干净的瓶子里装满10毫升过滤后的KCl溶液

——用针头注射器取出0.5毫升异丙酚

——在瓶子里注入1滴异丙酚和10毫升KCl溶液

——手旋转直到完全混合(10秒)

——用一次性移液管将400μL样品移入圆形一次性玻璃样品池

——将玻璃样品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打开样品盖

——将样品池和支架插入Nicomp系统，Holder支架背向Nicomp的左侧

——关闭Nicomp上的样品盖

确保仪器设置与如下所示的值匹配：

——单击绿色“G”图标开始测量

——打印并记录平均直径、标准偏差、PI 、D10、D50 和 D90

——将结果输入 Excel 电子表格

——计算五项分析的平均值和变异系数

——比较两个数据集

5、结果

样品在 A 和 B 系统上独立制备和分析。每个样品分析五次以检查重复性。这两个系统的示例结果如图 5 和图 6 所示。

整个结果以表格形式显示在图 7 和图 8 中。五个结果的叠加如图所示。

6、结论

查看综合结果可以得出以下几点观察结果：

——即使是相隔数年生产的两个系统也会生成相似的数据

——两个系统之间存在明显的 3% 偏差

——PI计算可能不是用于定义宽度分布的最 佳值

——如果使用PI，则30%的差值似乎是合适的

——D10、D50、D90 结果显示出更好的重现性，可能更容易为制药行业所接受

纯粹基于该数据集，基于三个测量的该药物产品的规格可能类似于：

——光强平均值 = 200 nm ±20%，COV = 小于 20%

——D10 = 140 nm ±30%，COV = 小于30%

——D90 = 284 nm ±30%，COV = 小于 30% 或

——PI = 0.09 ±30%

上述建议规格仅来自观察到的重现性，可能对药物安全性或有效性没有任何影响。USP <729> 中的实际是否通过标准的要求只是粒径尺寸必须低于 500 nm 并且具有低x2值。质量标准的另一种方法可能是关注影响有效性和/或安全性的粒径大小。本技术说明收集的数据是让您了解 DLS 技术对于简单样品的可重复性/重现性

7、仪器介绍

Nicomp纳米激光粒度仪系列

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然显示较好的分辨率和准确度。

高斯粒径分布图                         多峰粒径分布图 

参考资料

1 USP <729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions,http://www.usp.org/

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS),https://www.iso.org/home.html

3 USP <429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size,http://www.usp.org/

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015,https://www.fda.gov/media/87801/download

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods

Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation

动态光散射 (DLS) 正在成为制药行业中越来越流行的亚微米级药物粒度分析技术。本技术说明试图为使用此技术进行方法开发和验证放行测试的客户提供指导。

1、引言

虽然 DLS 在制药行业广泛使用，但关于方法开发和验证主题的文章很少。唯 一提及 DLS 的药典测试是 USP <729>脂质注射乳剂中的球体大小分布。1 因此，本文提供了有关在制药行业中使用 DLS 的一些见解。

2、USP<729>

此标准要求使用 100、250 和 400 nm 三个尺寸规格的 PSL 标准粒子来验证 DLS 系统。本文作者不理解为什么选择这些粒径，尤其是合格/不合格的标准是 500 nm。

许多使用DLS 的专家认为，仅以一种粒径进行测试应该即可验证系统是否正常运行。对这些标准进行3次测量，强度加权平均粒径和标准偏差应与预期值在可接受的误差范围内一致。而可接受的度是根据“在可接受的误差范围内”给出的。也许平均粒径在 ±10% 的范围内是合理的。

系统适用性部分指出，如果 CV 不超过 10%，则分析标准品时的重现性符合标准。通过 USP <729> 测试要求强度平均粒径小于 500 nm (0.5 µm) 并且卡方值 (x2) 保持“可接受的低”。Nicomp® 用户手册指出，良好的高斯结果的卡方值低于2 - 3。因此卡方值 <3 表示通过结果。

3、质量标准说明

因为USP <729> 测试是唯 一使用 DLS 的药典专著，其质量标准设定值得考虑，但药典质量标准不一定适合所有药物。一种更常见的规范方法是定义强度平均值的值和范围以及与分布宽度相关的一些计算。DLS 的 ISO 标准建议关注强度平均值和多分散性指数(PI)。2

作者看到的一些 DLS 规格包括 D10、D50 和 D90 的值。这些值可能来自制药行业广泛使用激光衍射进行粒度分析。USP <429> 测试光衍射测量粒径3经常使用 D10、D50 和 D90。设置质量标准的另一种方法是从USP<429>中借鉴重现性相关内容， USP <429> 中“重复”部分给出的基于体积分布的重现性范围为：

● D50 = 10%

● D10, D90 = 15%

● 在 10 µm 以下，这些最 大值可以加倍

遵循这些指南的内容，DLS 规格（根据定义尺寸小于 10 µm）对于强度平均值可以是可重复的 ±20%，对于 PI 或其他计算结果指示分布宽度是可重复的 ±30%。对于某些药品，这可能是一个可以接受的范围，但要注意当粒径非常小时出现的统计问题。如果平均粒径为 500 nm，±20%，则范围为 400 – 600 nm，这还不错。但对于平均粒径为 10 nm 的蛋白质，范围则为 8-12 nm，这样的粒径跨度变得非常挑战且难以接受。

4、方法开发

在开发方法之前，需要调查样品制备问题。这可以从简单的（将样品移入比色皿中）到复杂的（用表面活性剂和超声波分散）。样品制备的主题超出了本文档的范围，但已在之前的技术说明中讨论过。4 使用 DLS 制备样品进行分析时需要考虑的一些建议包括：

—— 测试浓度的影响。测量、稀释并再次测量。

—— 测试测量时间的影响。测量 3、5 和 10 分钟。

—— 确保任何稀释剂都经过充分过滤。WFI 可能不够干净。

—— 确保使用样品池都足够干净。

—— 是否应使用过滤器去除样品中的大颗粒？

—— 哪个样品池合适。

—— 调查任何可能影响结果的仪器设置。

优化样品制备步骤和仪器设置后，就可进行测试重复性实验。调查分析时间的微小变化是否对结果有任何重大影响。如果该方法需要 5 分钟的分析时间，则在 4 分 30 秒和 5 分 30 秒时测试。检查结果是否相同。

一旦方法得到优化，下一步就是按照标准 FDA 指南记录该方法。5 目标是足够详细地描述程序，以便其他操作员可以执行相同的测试并生成相同的结果。列出了必须包含的基本信息：

—— 原理/范围：分析测试/技术的基本原理。

—— 装置/设备：仪器类型、激光、检测器、检测角度和样品池类型。

—— 操作参数：温度、粘度、分析时间和通道宽度。

—— 试剂/标准品：用于验证性能的聚苯乙烯乳胶 (PSL)。PSS 建议使用 90 nm PSL（请参阅 Entegris 技术说明 - 系统验证）。

—— 标准控制溶液制备：稀释剂，稀释。6 

—— 程序：程序的逐步描述。将准备好的样品放入比色皿中，放入到系统中，定义参数并进行测量。

—— 系统适用性：测试以确保系统在使用时能够正常运行。6

—— 计算：所有结果计算通常直接在DLS 系统操作系统软件中进行。8 可以在电子表格中进行额外的统计计算。

—— 数据报告：数字数据、格式、有效数字的表示。Entegris 建议将结果重 点放在光强强度加权平均直径上。

5、关于参考标准和材料的说明

如上所述，我们认为单个粒径的测试足以验证系统是否正常运行。多家供应商提供多种粒径标准品，客户可以选择他们推荐使用的样品。但Entegris对两种 PSL 标准粒子拥有丰富经验，这些也是我们通常建议客户用来验证其 Nicomp6 的样本。Thermo Fisher 3000 系列 NIST 可溯源 90 nm 标称 PSL 标准通常用于验证 Nicomp 性能。样品的目录号为 3090A，认证值为 92 ± 3 nm。另一个经常使用的样品是 Thermo Fisher 目录号 5009A，值为 90 nm。该样品不可追溯到 NIST，但我们有足够的经验推荐使用该样品，而且它比 3000 系列产品便宜。

注：DLS 是一种不需要校准的第 一原理技术。该系统使用一种或多种 PSL 标准进行验证。如果系统未通过验证步骤，则无法进行调整以使结果进入预期范围。验证结果失败可能是由于系统工作不正常而需要维修，或者更常见的是标准粒子准备不当，应在尝试另一次测量之前重新准备。

6、仪器介绍

Nicomp纳米激光粒度仪系列

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然显示较好的分辨率和准确度。

高斯粒径分布图                     多峰粒径分布图

参考资料

1 USP <729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions,http://www.usp.org/

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS),https://www.iso.org/home.html

3 USP <429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size,http://www.usp.org/

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015,https://www.fda.gov/media/87801/download

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods

Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation

近年来USP和ICH都针对分析方法开发与验证进行了修订。USP新收录通则<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，分别从分析方法开发、分析方法性能确认及分析方法使用三个阶段分别阐述如何在分析方法整个生命周期内对方法进行管理。而ICH Q14分析方法开发和Q2(R2) 分析方法验证的修订也进入到了第三阶段，按照计划其将在2023年5月前完成阶段的定稿。这些信息都表明了分析方法开发和验证的管理将会变得更严谨、更科学。

因为色谱仪器包括色谱-质谱联用技术在药物开发过程中的广泛使用，色谱分析方法的开发与验证也成为了方法开发与验证，乃至分析方法生命周期管理中的重要内容。针对色谱方法开发与验证的整体流程，可以将其大致分为：方法筛选、方法优化、耐用性测试和完整的方法验证这四个阶段。

而这四个阶段都离不开仪器准备、队列运行、数据查看与处理以及报告这几个环节。赛默飞的旗舰版色谱数据系统Chromeleon 软件功能丰富而注重实践，能够帮助实验室的色谱分析实现精简、高效的工作流，以实现更快的样品到结果的转换。

自定义变量的灵活应用

在Chromeleon CDS 中创建队列时可以通过手工填写的传统方式，也可基于事先建好的队列模板。值得一提的是Chromeleon 强大的样品列表功能。除了运行样品的基本信息（样品名称、仪器方法、运行的其他必须参数）之外，还可以通过自定义变量的形式，添加额外的注释信息，例如色谱柱类型、缓冲液名称等用于清晰识别每一针进样的信息。

使用者还可以进一步创建一些自定义变量并将其与仪器方法中的参数进行链接，更加简单地实现实验设计（DoE）的环节。一旦基本方法固定，便可通过改变色谱柱选择阀或溶剂选择阀等参数实现不同要素的组合以寻找具备可行性的色谱条件，也体现了ICH和USP所倡导的“多变量分析方法开发”这一方针。相比传统的样品队列创建方式，减少了所需创建的仪器方法的数量，并以清晰直观的模式展示了所使用的变量以及变量值，结合缩略图功能提供了更直观的信息。

在数据处理阶段，可以再次利用Chromeleon 样品列表中的自定义结果变量功能，可以方便地实现运行样品的同时进行结果计算，例如系统适用性参数的计算，峰面积、含量以及测试是否通过等信息的显示，帮助使用者快速查看所需信息以便灵活调整实验的方向。

完全可定制的

Chromeleon

报告模板也支持自定义变量、公式和计算，使用者可以使用内置的模板，也可以根据需要进行调整，得到包括多个工作表、结果表和图形的报告，无需导出到其他软件，也无需手动计算，从而消除转录错误。所有报告和计算都可以在合规的环境中完成，并在源数据发生变化时自动更新。可以选择在运行结束时自动打印、导出也可以发送电子邮件通知给相关人员。

更便捷的eWorkflow

Chromeleon 也提供一个创建序列、运行并得到结果的简单而直接的方法，这就是eWorkflow。它最 大限度地减少了操作步骤并涵盖了色谱或 MS 工作流程的所有方面，定义了可以在哪些仪器上运行分析以及应该使用哪些方法和文件，包括仪器方法、处理方法、报告和外部文件，例如 SOP。 

与前面提到的自定义变量等有效结合，只需单击几下即可创建复杂的序列并立即运行，并在运行后得到所需的报告。这些都可以减少错误、更快地产生可靠的结果，并且显著减少了培训的需求，有效加速了方法开发的流程。

分析方法验证工具包

ICH指南定义了方法验证应该执行包括专属性、准确度、精密度、检测和定量限度、线性、范围和耐用性的测试。除了样品运行的环节之外，计算、整理和报告验证结果也可能需要很长的时间，而且大多数测试都涉及将结果与指标进行比较，相对比较繁琐。 

在eWorkflow的基础上，Chromeleon 又提供了一个方法验证的高效工具，ICH方法验证扩展包。扩展包内有一系列的模板，每个模板都包含处理方法、报告模板和自定义变量以覆盖所需的变量和参数。所有这些都在 eWorkflow 程序中捆绑在一起，以确保正确执行ICH所要求的相关测试，减少人为错误并加速流程：eWorkflow 可以引导创建队列，自动执行所有计算，并通过报告直接显示通过或失败的结论。

以上介绍的几个工具仅为Chromeleon 强大功能的冰山一角。结合Chromeleon 实用的多厂商仪器控制能力，出色的系统适用性和智能运行控制功能，便捷的数据积分、处理功能，直观的图形化显示，全面的合规能力，Chromeleon不但可以提升方法开发、验证的效率，也一定能够帮助色谱工作者执行分析方法生命周期的管理。