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  可爱的好事 2016-06-23 00:00:00

  植物基因组DNA提取试剂盒使用方法如下： 操作步骤：使用前先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、植物组织预处理：取新鲜植物组织（不超过100mg）或干重组织（不超过20mg），于液氮中充分研磨至细粉状，让液氮自然挥发。 2、将研磨好的植物组织粉末迅速转移到预先装有400ul溶液PA、20ul RNase A（10mg/ml）和5ul β-巯基乙醇的离心管中，充分颠倒混匀，室温放置10min。 3、加入140ul溶液PB，充分颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上清转移至新离心管中(约400-500ul)，注意不要吸入沉淀。 4、加入和上清相同体积的溶液PC，充分颠倒混匀，再加入和溶液PC相同体积的无水乙醇，此时若出现絮状物，将絮状物吹散后一起加入吸附柱中，12000rpm离心5min，弃废液，一次加不完可分两次加入。注意：如果吸附柱膜呈绿色或离心时有堵塞现象，可向吸附柱中加入600ul无水乙醇，并适当延长离心时间。 5、 向吸附柱中加入600ul漂洗液(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。 6、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中， 12000rpm离心2min。 7、将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，否则残余的乙醇可能会影响后续的实验如酶切、PCR等。 8、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜ZY悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置1-5min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的植物基因组DNA。 9、(可选)离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min。 注意事项： 1、组织应尽量选取新鲜幼嫩样本，富含多糖多酚的组织可能会提取失败，请选用多糖多酚专用试剂盒。 2、如果试剂盒中的试剂出现沉淀，可在65℃水浴中融化，不影响使用。 3、洗脱缓冲液的体积不能小于50ul，DNA产物应-20℃保存。 动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒使用步骤如下： 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入休积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、样品的处理： a、细胞：取1×106-1×107个悬浮培养细胞，12000rpm离心1min收集细胞，贴壁细胞先用胰蛋白酶消化处理，再用预冷的PBS吹打成细胞悬液，然后12000rpm离心1min收集细胞，尽量除去上清，加200ul溶液A，振荡至彻底混匀。 b、组织：组织量不宜过大，一般不要超过25mg，可以使用匀浆器匀浆，Z好用液氮研磨成粉末状，再用预冷的PBS或无菌水充分悬浮，然后12000rpm离心1min收集细胞，尽量除去上清，加200ul溶液A，振荡至彻底混匀。 2、向悬浮液中加入20ul 的RNase A (10mg/ml)，55℃放置15min。 3、加入20ul 的蛋白酶K( 10mg /ml )，充分颠倒混匀，55℃水浴消化，细胞消化时间较短，组织消化时间较长，一般需要1-3个小时才能完成（鼠尾需要消化过夜）。消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。消化完全的指标是：液体清亮及粘稠。 4、加入200ul体积溶液B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可放置于75℃ 15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致堵塞吸附柱。 5、加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中。 6、12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 9、12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。 10、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜ZY悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心2min。 11、可将离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。 注意事项: 1、试剂盒拆封后，RNase A和蛋白酶K需放置-20℃保存。 2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。 3、如果试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响效果。 4、洗脱缓冲液的体积Z好不少于50ul，体积过小会影响回收效率：洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH 值低于7.0会降低洗脱效率。 细菌基因组DNA提取试剂盒使用方法如下： 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。 所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、取细菌培养液1ml，12000rpm离心1min.，尽量吸除上清。 2、向菌体中加入200ul溶液A，振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮（如果是革兰氏阳性菌，可在此步骤加入终浓度为20mg/ml的溶菌酶），向悬浮液中加入20ul的RNase A (10mg/ml)，充分颠倒混匀，室温放置15-30min。 3、向管中加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分混匀，55℃消化30-60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止，此时可见菌液呈清亮粘稠状。 4、向管中加入200ul溶液B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可于75℃放置15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如果溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能会导致DNA的提取量以及纯度降低，还可能堵塞吸附柱。 5、向管中加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时还可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中，静置2min。 6、12000rpm离心2min. 弃废液，将吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、向吸附柱中加入600ul漂洗液， 12000rpm离心l min， 弃废液，将吸附柱放入收集管中。 9、12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。 10、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜ZY悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。 11、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min ，12000rpm离心2 min，即可得到高质量的细菌基因组DNA。 注意事项: 1、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。 2、若试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响提取效果。 3、如果实验中的离心步骤出现柱子堵塞的情况，可适当延长离心时间。 4、洗脱缓冲液的体积Z好不少于50ul，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)， pH值低于7. 0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。 5、 DNA浓度及纯度检测：得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。 回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1.0相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/0D280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

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