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我们提供给您符合中国药典生物检定法要求的 4.4 法分析模板，第 一步将模板导入 SoftMax Pro 7 软件，第二步点击 Read 进行板测读，随后平行线性拟合、方差分析和可靠性检验结果、供试品效价及其可信限全部自动计算出来。

肝素及其效价测定方法介绍

肝素首先从肝脏发现而得名，它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是一种由动物结缔组织的肥大细胞合成的粘多糖，是由二种多糖交替连接而成的多聚体。它是一种天然的抗凝血物质，在体内外都有抗凝血作用，临床上常用其钠盐或钙盐。肝素钠或肝素钙注射液主要是从猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐或钙盐，作为迅速达到抗凝作用的首 选药物，被广泛用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。

肝素类产品的效价不能用化学或物理的方法进行确切测定，只能采用生物检定法测定，即利用药物对生物体的作用并与标准品加以比较以测定其效价和生物活性的一种方法。目前体外的抗凝活性实验主要有血浆法和生色底物法，血浆法虽然可以全面衡量肝素的抗凝活性，却很难标准化；生色底物法测定肝素钠的抗 IIa 因子和 Xa 因子活性虽然不能完全反映肝素钠的活性，但国际上通常采用这种方法来确定肝素钠的效价。欧洲药典 5.0 版和我国药典均采用该方法，美国药典从 2009 年开始采用生色抗 IIa 因子测定法代替此前药典中的羊血浆法测定肝素效价。生色底物法 最 大的优点是它在效价测定中的高度专一性，能够识别出此前药典中血浆法不能识别的肝素相似性潜在药物，并且酶标仪的使用使常规测定自动化和标准化。

仪器型号

• SpectraMax M2e 多功能微孔板读板机

• SpectraMax M5e 多功能微孔板读板机

• SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机

• SpectraMax iD3 多功能微孔板读板机

生色底物法的原理是通过微量显色法比较肝素钠标准品 S 与供试品 T 抗 IIa 因子和 Xa 因子的活性，以测定供试品的效价。效价是某种药物达到一定效应时所需的剂量，产生相同效应药物的剂量比较时，所需剂量越小，药物的效价就越高，反之效价就低。在人或动物体内，发生凝血作用的主要是凝血酶，低分子肝素在人体内与抗凝血酶形成络合物，然后抑 制凝血酶（IIa 因子或 Xa 因子）的活性，达到抗凝血的作用，剩余未被抑 制的 IIa 因子或 Xa 因子与生色底物作用显色，使用酶标仪在 405nm 波长处读取吸光度，终溶液的吸光度值与低分子肝素的效价成反比。以吸光度为纵坐标，标准品系列溶液（或供试品系列溶液）浓度的对数值为横坐标分别作线性回归，按生物检定统计法（通则 1431）中的量反应平行线原理 4.4 法实验设计，计算效价及实验误差，药典要求可信限率（FL%）不得大于 10 %。

使用 SoftMax Pro 7 软件进行肝素效价测定

生物检定统计法中涉及到的 F 检验分析方法的推算比较复杂，大多数酶标仪的软件是无法完成这些计算的，但是，Molecular Devices 公司的酶标仪软件 SoftMax Pro 7 具备强大的函数编写能力，能够帮助实验人员完成药典中要求的生物检定统计法的所有分析方法，包括量反应平行线测定法和四参数回归计算法。下面小编以一组实验数据来详细说明，在 SoftMax Pro 7 软件中如何进行肝素生物效价的测定，并将方差分析和和测定结果与 BS2000 软件进行比较。

加样原则

为了减小实验系统操作误差，实验人员应该按照均衡分配各样品在 96 孔微孔板中的不同位置。例如在一块 96 孔微孔板上分配一组标准品溶液 S1~S4 和一组供试品溶液 T1~T4，可以采用 STTS 的样品排列方式（见图 1）。操作熟练的实验人员可以选择同一次反应内测定多批供试品的效价，同时测定两批供试品（A 和 B）可采用 SABBAS 的排列方式；依次类推，同时测定三批供试品（A、B 和 C）可采用 SABCCBAS 的排列方式（见图 2）。

图 1 一组标准品溶液和一组供试品溶液的加样顺序

图 2 一组标准品溶液和三组供试品溶液的加样顺序

实验数据测读

在 SoftMax Pro 7 软件中进行相应排列方式的板布局设置，并输入标准品系列溶液和供试品系列溶液的剂量。本次实验只有一组标准品溶液和一组供试品溶液，S 和 T 采用同等剂量稀释，最 大剂量是 0.049 IU/ml，高低剂量剂间比是 1.4，然后在 405 nm 波长下进行读数，稀释剂量和检测结果如图 3 所示。

图 3 标准品 S 溶液和供试品 T 溶液的剂量（左）及酶标仪的检测结果（右）

平行线性拟合

当标准品 S 和供试品 T 的对数剂量和反应关系的两条直线相互平行时，供试品和标准品的活性组分才是相同的，进而才能计算 S 和 T 的等反应剂量，从而对比出供试品的效价 Pt，所以曲线的平行性分析是生物效价测定的前提。在 SoftMaxPro 软件中，以对数剂量作为横坐标，吸光度值作为纵坐标，对 S 和 T 进行平行线性拟合（即线性约束模型拟合），两条直线强制变为平行，S 和 T 拟合方程的 B 参数（代表斜率）的估计值是相同的，仅 A 参数（代表水平截距）的估计值不同。在95% 的置信水平下，软件自动计算出 F 检验概率值（F Prob），见图 4 红框所示，F Prob > 0.05，表明两条直线是平行的，反之两条直线是不平行的。

图 4 S 和 T 的平行线性拟合。红框中是平行性分析自动计算得出的 F 检验概率值，此值大于 0.05，表明两条直线是平行的。

方差分析及可靠性检验结果

按照药典量反应平行线测定法中方差分析的要求，将总变异进行分解：总变异、剂间变异、区组间变异（随机区组设计）和误差变异，再通过对剂间变异的分析，以检验标准品和供试品的对数剂量和反应的关系是否显著偏离平行直线。4.4 法的剂间变异被分解为以下 5 个变异项：试品间变异、回归变异、偏离平行变异、二次曲线变异和反向二次曲线变异。药典列出了各个变异项及其自由度的推算公式，我们将这些公式编辑到 SoftMax Pro 7 软件中，上述实验检测数据的方差分析和可靠性检验结果将会被计算出来（见图 5 上）。小编将上述实验检测数据手动输入 BS2000 软件，需要注意的是，输入数据时应按照剂量递增的顺序依次输入吸光度值，供试品的标示效价 At 为 5000 IU/ml，接着选择数据不转换和完全随机，最 后得到方差分析结果（见图 5 下）。通过比较，两个软件获得的可靠性检验结果是一致的。

图 5 SoftMax Pro 7 软件可靠性检验结果（上）和 BS2000 软件可靠性检验结果（下）

效价和可信限计算

根据 F 检验的统计分析结果，如果符合药典中可靠性测验结果判定条件，那么实验结果被认为是可靠和有效的。只有实验结果是有效的，方可按等反应剂量比的原则，计算供试品的相对效价 R 和效价 Pt 及其可信限和可信限率，反之，实验结果不成立，R 和 Pt 的结果是无效的。药典对 4.4 法可靠性检验结果的要求是：回归项非常显著（P<0.01），偏离平行、二次曲线和反向二次曲线各项均不显著（P>0.05），满足这些条件才能判定实验结果成立。使用 SoftMax Pro 7 软件对相对效价 R、R 对数的标准误 SM 和供试品效价 Pt 及其可信限和可信限率进行计算，结果见图 6 上，BS2000 软件的计算结果见图 6 下。两个软件计算的效价 Pt 都在客户允许的产品质量标准浮动范围内，可信限率都小于 10%，符合药典对肝素产品的要求。

综上所述，SoftMax Pro 7 软件具备专业的高级统计学分析的能力，不仅支持自由模型和约束模型拟合进行平行性检验，还能完成方差分析和可靠性检验的各种复杂公式的运算，帮助实验人员高效的完成肝素产品生物效价的测定。而且，SoftMaxPro 7 软件是集仪器控制、数据采集及数据分析于一体的合规软件，不需要将读板数据导入或输入到第三方软件进行统计分析，规避了数据安全性和完整性的审查风险。另外，我们已经在 SoftMax Pro 7 软件中建立了符合中国药典生物检定法要求的随机区组设计 3.3 法分析模板、随机设计 3.3 法分析模板、随机设计 4.4 法分析模板、随机设计 4.4 法 - 对数转换分析模板及四参数计算回归法分析模板，如果您有需要，请联系我们。