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「“沃”的实验」之安全高效

动物手术造模全攻略栏目

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数十种动物造模实验SOP

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第一期麻醉定位造模实验

与精彩答题PK中奖活动

第二期创伤性颅脑损伤造模实验

与疑难点揭示

第三期动物麻醉造模实验

与动物福利之间博弈思考

第四期动物给药造模实验中

不同动物给药实验分类展示

第五期线栓法

构建局灶性脑缺血模型实验详解

五期满满详细内容干货

是宝们顺利推进实验的有效利器

五期步步流程清晰讲解

是小沃与宝们的珍贵实操经历

小沃由衷希望我的科研宝们

能够在山重水复疑无路的时候

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柳暗花明又一村的灯塔

在衣带渐宽终不悔的奋斗中

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下次再见将更精彩

鞘内给药通过将药物直接注入脑脊液，绕过血脑屏障进入中 枢神经系统，是研究脊髓水平药物作用机制的常用给药方式，广泛用于损伤、疼痛、中 枢神经系统疾病以及癌症治疗等研究领域。通过鞘内置管，可以使药物根据需求有选择性地注入脊髓，如接入缓释泵进行持续输注（参考文章缓释泵使用小贴士），或者注射器等多次注射。常用的鞘内给药置管方法包括经延髓池(cisterna magna)鞘内置管和腰椎脊髓鞘内置管。

一、小脑延髓池置管

1、实验仪器耗材

脑立体定位仪、体视手术显微镜、吸入式麻醉机、加热垫、手术器械、缝合线、70%酒精、组织粘合剂、32G鞘内PU导管（带结节用于锚定组织）等。

2、实验步骤

麻醉

1. 小鼠置于诱导盒内给予4%的异氟烷麻醉。

2. 确认老鼠在失去反应能力后，用电动剃须刀将动物颈部到头部的的皮肤脱毛。

3. 将耳杆正确插入小鼠耳道进行定位仪固定，嘴部置于口部麻醉面罩上以持续麻醉(2%异氟烷)，加热垫(37℃)维持体温。

4. 70%乙醇擦拭剃毛部位皮肤进行消毒，可涂抹眼药膏保护小鼠眼睛。

暴露寰枕膜

1. 用手术刀沿颈部中线（枕骨嵴处）做一个2-3厘米长的纵向皮肤切口。

2. 继续沿皮肤切口向下切开枕骨上方肌肉，用手术挂钩将肌肉从枕骨拉至两侧固定，暴露寰枕膜。

3. 显微镜视野下用剪刀小心地在寰枕膜开一个缝，暴露脑干。此时脑脊液会从由此切口渗出。注意寰枕膜切口要尽可能浅，避免损伤脑干。

寰枕膜解剖图^[1]

置管

1. 移动定位仪面罩，调整小鼠头部，使头部朝下与身体成90度角。

2. 将导管修剪到所需长度，显微镜视野下轻轻将导管插入延髓池。保持导管角度与脑干的背侧表面平行，向尾部方向缓慢推进到脊柱内所需位置。

3. 采用组织粘合剂将导管结节固定在颅骨上，取出手术挂钩缝合两边肌肉进一步稳固结节，确保鞘内导管长期稳定。

小脑延髓池（cisterna magna）置管^[1]

可选操作：缓释泵鞘内给药

1. 选择缓释泵鞘内给药方式需预先进行缓释泵灌充、鞘内导管连接、泵体孵育等准备操作参考（参考文章缓释泵试 用小贴士）

2. 用止血钳自颈背部切口分离背部皮下组织，打通皮下隧道形成空隙。

3. 将缓释泵植入空隙中，使用缝线将所有皮肤切口缝合完整。

术后恢复

1. 可在术后给予腹腔注射5%葡萄糖，补充能量

2. 为预防术后感染，可服用预防性抗生素如恩诺沙星等。

3. 定期检查小鼠是否有肢体功能障碍、疼痛或手术不良反应，剔除影响实验的不良个体。

注意事项

1. 切开寰枕膜时很容易损伤脑干，要尽量从表面切开，注意不要压迫脑干，可能会导致呼吸抑制。

2. 将头部屈曲90°角对于导管正确进入延髓池及后续插入非常关键。

3. 导管插入过程必须注意确保动物脊椎笔直，可以通过轻拉尾巴施加张力以使脊椎对齐。

4. 注意切割方向应与动物背部平行，避免损伤深层肌肉层或其他组织结构。

二、腰椎脊髓鞘内置管

1、实验仪器耗材

体式手术显微镜、吸入式麻醉机、加热垫、钻子、手术器械、缝合线、70%酒精、组织粘合剂、32G鞘内导管（带结节用于锚定组织）等。

2、实验步骤

麻醉

1. 小鼠置于诱导盒内给予4%的异氟烷麻醉。

2. 确认老鼠在失去反应能力后，用电动剃毛刀将背部皮肤脱毛。

3. 持续给予麻醉(2%异氟烷)，将小鼠置于加热垫(37℃)维持体温。

4. 70%乙醇擦拭剃毛部位皮肤进行消毒，可涂抹眼药膏防止眼睛干燥

暴露脊柱

1. 用手术钳和手术刀在背部中线处做一个2-3厘米长的纵向皮肤切口。

2. 识别第六腰椎(L6)的脊柱突，用手术刀切开L6-L2脊柱突周围肌筋膜。用镊子将肌肉组织从椎板中分离出来，用手术挂钩将肌肉拉至两侧固定，暴露L6/L5椎板。

3. 显微镜视野下用钻子在椎板上钻孔直到剩下薄骨层，避免钻透。脊髓组织此时可以透过骨层看到。

腰椎切口示意图^[3]

置管

1. 显微镜视野下小心将钻孔切开小缝，此时脑脊液会由此切口渗出。注意避免脊髓或其血管受伤。

2. 将导管修剪到所需长度，在显微镜视野下将导管轻轻插入鞘内间隙。保持导管角度始终平行于脊髓，向头部方向缓慢推进到脊柱内所需位置。

3. 取出手术挂钩缝合两边肌肉将导管结节稳固在肌肉内，确保鞘内导管长期稳定。

4. 用止血钳自背部皮肤切口往小鼠头部方向分离背部皮下组织，打通皮下隧道，将导管回绕顺着皮下隧道从颈部穿出。

腰椎置管^[4]

可选操作：缓释泵鞘内给药

1. 缓释泵准备工作同上

2. 用止血钳自背部皮肤切口往小鼠头部方向分离背部皮下组织，打通皮下隧道形成空隙。

3. 将缓释泵植入空隙中，注意此时泵体应该处于胸背部，缓释泵流量调节器应该对准尾巴方向（注意不能往尾部方向打通隧道，因为将泵体放置在髋骨上方，可能引起局部骨刺激）。

4. 使用缝线将所有皮肤切口缝合完整。

恢复

同上所述

注意事项

1. 导管插入过程必须确保始终平行于脊髓。这样有利于插入，同时降低神经损伤风险。

2. 导管插入较小的鞘内间隙如中段胸椎脊髓时，可能引起脊髓炎症和压迫，应特别小心。

3. 正确的导管插入过程应顺利进行，推进过程中出现推进不顺畅，动物甩尾或腿跳动等现象都反映插入不良，可稍微抽出导管并尝试再次插入。

4. 缝线不要太紧，因为如果缝线太紧，可能会影响导管的通透性。

缓释泵持续给药方式已经被普遍应用于鞘内慢性给药，如脊髓损伤、疼痛以及神经疾病等研究领域，扫描下方二维码，申请免费试 用！

【参考文献】

1.Seung AC, et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 2016;16(1):723

2.Malkmus SA, et al. Intrathecal catheterization and drug delivery in the rat. Methods Mol Med. 2004; 99:109-21

3.Mazur C, et al. Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat. J Neurosci Methods. 2017; 280:36-46

4.Wu WP, et al. Chronic lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in mice. J Neurosci Methods. 2004;133(1-2):65-9

各位小伙伴们，好久不见呀~~

春节长假在我们恋恋不舍的目光中绝尘而去！！

当时的“节后再说”有多爽

现在的开工就有多吐血

面对那一茬接一茬的实验

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01

神经系统研究

神经系统研究手术与造模大全囊括了神经科学领域最常使用的动物实验操作技术以及动物模型构建的方法，具体内容包括相关疾病的研究背景、模型构建的操作和评估方法以及参考文献，为您提供规范的实验操作流程和更多的模型选择，提高实验的成功率和可重复性，助您实验顺利开展。

02

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本手册详细介绍四大疾病模型，包括高血压、脑卒中、动脉粥样硬化、下肢缺血动物疾病模型，构建方法多达17种，助你开拓科研新思路！

03

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这本手册涵盖7大肿瘤疾病模型和15种构建方法，概述了不同模型应用场景、优缺点、使用时应考虑的因素等内容，为您提供更多的动物模型参考和更适合的模型选择。

04

代谢类疾病研究

该手册涵盖常见的脂肪肝模型、1型和2型糖尿病模型、肥胖疾病模型的构建与评估方法；详细介绍了不同模型的应用场景、优缺点、使用时应考虑的因素等内容，助你快速找到合适的代谢类实验模型！

05

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此手册涵盖哮喘、慢阻肺、急性肺损伤、肺动脉高压、肺纤维化等五大呼吸系统常见疾病的造模及评估方法；以及详实的实验步骤如材料和试剂、设备、操作流程等，为您提供规范完整的实验操作方法。

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实验室里，大家眉头紧锁，似乎都在为自己的课题实验焦头烂额，

百思不得其解。

这一幕，是不是觉得似曾相识？

实验过程和结果不尽人意

问题迟迟找寻不出

颅脑损伤手术真的有这么劳神费力么？

“沃”的实验 栏目之

安全高效动物手术造模全攻略 第二期

《颅脑损伤手术标准操作流程指引》

为你揭开它的神秘面纱~~~

详实地为大家讲解手术实验每一个步骤

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圆形电动升降水浴氮吹仪是利用吹扫捕集技术，同时可对样品进行控温加热，通过氮气等惰性气体快速、可控、连续地吹到样品表面来达到样品溶液快速无氧浓缩。该方法具有省时、便捷、准确的特点。广泛用于食品安全、医药、农药残留检测、临床药代等域。

氮吹仪的工作原理：

氮吹仪是采用惰性气体对加热样液进行吹扫，使待处理样品迅速浓缩，达到快速分离纯化的效果。其方法操作简单，尤其可以同时处理多个样品，大大缩短了检测时间。用于除去少量易挥发的液体，比如水和些有机溶剂，在实验室用得比较多。特别是使用旋转蒸发仪也不够保险的场合(溶剂会暴沸)，改用氮吹仪较理想。

氮吹仪利用氮气的快速流动打破液体上空的气液平衡，从而使液体挥发速度加快;并通过干式加热或水浴加热方式升高温度(目标物的沸点般比溶剂的要高些)，从而达到样品无氧浓缩的目的，保持样品纯净。

使用氮吹仪代替常用的旋转蒸发仪进行浓缩，能同时浓缩几十个样品，使样品制备时间大为缩短，并且具有省时，易操作，快捷的特点。

02

氮吹仪的主要分类

1. 按仪器加热槽结构分为：方形与圆周型氮吹仪

2. 按仪器加热方式分为：金属干浴式和与水浴氮吹仪

3. 其中金属干浴式的加热载体又有铝块孔式干浴、铝珠浴、细黄沙浴之分，这里面以铝珠浴*上等

03

氮吹仪的适用范围：

农残分析：如蔬菜、水果、谷物、植物组织;

环境分析：如饮引用水、地下水和污染水水样;

食品饮料：如牛奶、酒、啤酒等;

生物分析：如血清、血浆、血液、尿液等;

商品检验：如检验克罗夫特等;

制药药检：如中药制药等。

04

氮吹仪的常见问题

1、氮吹仪的用途：

用于除去少量易挥发的液体，比如水和些有机溶剂，在实验室用得比较多。氮吹仪典型的应用是在固相萃取-气相色谱检测中，固相萃取取完后可用氮吹仪将洗脱液中大部分溶液吹掉，即完成了个浓缩过程，后便可上机进样检测了。

2、氮吹仪氮气源应用是怎样的?

如使用量较大的话建议买个氮气发生器;

检测某些项目时氮吹仪是*的，使用高纯氮气便可;

气相的氮气般都是99.99%以上，氮气使用2-3个便可。

3、在哪些实验中会用到氮吹仪?

氮吹仪采用惰性气体对加热样液进行吹扫，使待处理样品迅速浓缩，达到快速分离纯化的效果。该方法操作简便，尤其可以同时处理多个样品，大大缩短了检测时间。

4、氮吹仪的四大优势

氮吹仪也叫自动快速浓缩仪，氮气吹干仪等。目前，氮吹仪已经代替传统的旋转蒸发仪。相对于传统的旋转蒸发仪，氮吹仪具有如下优势：

a、旋转蒸发仪在溶剂沸腾时可能会造成样品的损失，而氮吹仪在浓缩时准确、灵敏可避免样品损失。

b、氮吹仪可以次性处理多个样品，在多水平以及多因素的重复试验中可凸显其优势。

c、氮吹仪在实验中操作者不需要长时间的维护，可节省人力。

d、实验操作简洁、灵活。可以随时随地调节浓缩的进程。

5、为了安全起见，使用氮吹仪应注意些什么?

a、氮吹仪在同样环境条件下，加热媒质的干湿、通风橱内污染程度以及吹扫气体的纯度都将影响蒸发浓缩效果。

b、氮吹仪应当在通风橱中使用,以保证通风良好。

c、使用氮吹仪时,应保护好手和眼睛。

d、不要使用酸性或碱性物质,否则将会损毁氮吹仪。

e、加热时不应移动氮吹仪,以防烫shang。

f、调节时应尽量用手扶住通气板，使其能平稳升降，也避免由于通气板自身重力下降导致试管损坏，造成不必要得损失。

g、开始通入氮气时，应缓慢开启阀门，使其压力不超过压力表量程，防止样品溅起，造成损失和污染，也防止损坏压力表。

h、不将氮吹仪用于燃点低于100℃的物质，像石油醚等的高易燃物质不应使用氮吹仪。

i、为防止交叉污染，氮吹仪每次使用后，应及时清洗气针管。

05

氮吹仪的维护保养

以下简单介绍在氮吹仪在检测过程中的九大注意事项。

1、做好手和面部的防护工作

在做样品加热过程中，以防水浴池中的热水飞溅出来，烫shang手和眼睛，在操作前需做好手和面部的防护工作，佩戴手套、眼罩。

2、保证通风良好

在操作中为阻止些蒸气、气体和微粒(烟雾、煤烟、灰尘和气悬体)被载入仪器中影响实验的京准性，需采用通风橱、通风罩或局部通风的方法操作，将污染物质除去。

3、勿移动氮吹仪

在试验中勿移动氮吹仪，实验仪器处于高温加热状态，以防烫shang。

4、使用三线接地电源

氮吹仪功率较大，在使用是须使用三线接地电源，以保证用电安全。

5、勿带电打开水浴外壳

在实验过程中，仪器带电工作，以防水浴池里的物质通状况下发生漏电、触电意外，发生危险，请勿带电打开水浴外壳。

6、禁止非专页人员检修仪器

氮吹仪的检修工作应当由专页人员进行，因其内部构造为复杂，元器件替换不当可能引起氮吹仪损坏或产生安全隐患。

7、不宜检测高易燃物质

高易燃物质，如：石油醚，在高温加热试验下易产生爆炸，因此，氮吹仪不宜检测高易燃物质。

8、勿使用酸性或碱性物质作加热介质

不要使用有机溶剂作加热介质，有机溶剂具有挥发性、神经毒性，吸入会产生头晕、头tong、失mian、多梦、嗜睡、无力、记忆力减退、食欲不振、消瘦，以及多汗、情绪不稳定，心跳加速或减慢等现象。*好使用蒸馏水和去离子水作为加热介质，不安全，能有效防止在水浴壁上产生水垢。

9、勤洗水浴池

实验完成后，不加热时，在水浴的水中加入除藻剂，可防止生物污染。不应使用酸性除藻剂，并应确保所用除藻剂不会影响所要处理的样品。当接触或暴露于酸性材料、蒸汽或样品后，应当立刻清洗，用适度的碳酸氢钠溶液或其它相似溶液中和，再用清水冲洗。长时间接触酸性物质，将会损坏仪器。水浴中的水建议周换，长不超过月。

小师妹：师姐，我要研究药物与恐惧记忆关系，求指导！

大师姐：通常认为恐惧记忆与杏仁核相关(Gallagher and Chiba, 1996; Swanson and Petrovich, 1998)，如果你想研究药物与恐惧、奖赏等行为关系，你需要先研究药物与杏仁核的关系。在对杏仁核进行脑立体定位注射时，分为单次注射与多次注射，单次注射可直接使用KDS 130配合定位仪进行。如果需要多次反复给药，就需埋置套管。杏仁核可区分为BLA(基底外侧杏仁核)与CE(ZY杏仁核)，通常这两个脑区会有不同研究方向。比如BLA多与奖赏挂钩，CE主要与焦虑、恐惧相关(Kim et al., 2017)。具体坐标你可以参考文献与脑图谱。

图片来源于网络

为什么要采用颅脑给药的方式

       首先，采用颅脑给YF式是为了确保实验结果准确。血脑屏障的存在，会导致大部分物质无法到达颅脑。即便目标物质通过腹腔或者血管注射，经过体液循环进入了颅脑。但在这个过程中，大部分药物会被代谢。也就是说通过这种方式进入颅脑的物质，已经不是我们原先注射的药物，而是该物质的代谢物。这样得到的实验结果并不一定准确，需要对进入颅脑的代谢物进行检测，确定其结构。

       其次，这种给YF式有助于提高药物（特别是高价值药和自提药物）的使用效率。腹腔注射药物量往往比颅脑注射药物量要高几十倍（具体换算比例依照药物而定）。因此，当药品有限时，采用颅脑给药，能极大降低药品损耗。

为什么需要埋植套管

进行颅脑微量给药

这对实验有什么帮助

       导管，又名套管，其主要作用是通过立体定位埋植于小动物的目标脑区，结合注射泵、注射器、PE管、注射内针、锁紧螺帽等仪器，实现在特定脑区进行多次微量给药。套管常常使用在颅脑给药中。

       颅脑属于高精密、脆弱器官，内部虽有足够缓冲余地，但充满了脑脊液。脑组织既被颅骨保护，又被颅骨限制了空间，所以只适合微量缓慢注射给药，以减少对脑组织的损伤，同时保证药液进入目标区域。

       当我们需要短时间内连续颅脑给药时（比如连续7天），若采用立体定位注射，则每次都需要进行抓取、麻醉、立体定位、转孔注射药物操作。这样会给动物带来很强刺激，使得动物长时间处于应激状态，导致动物行为与代谢不正常。对后续行为学、化学、电学检测均有较大影响。而套管给药可以带来以下两个好处：

       1. 仅需一次埋植工作，就可实现长时间反复给药，使用方便GX。并且可避免反复拔插脑组织，保护脑组织不受二次伤害。

       2. 埋植后，可在动物清醒状态下进行给药实验，既适合给药后即刻对动物进行检测（行为学、电生理、光遗传等），也能在给药后较长时间内对动物进行检测（比如给药48h后检测）。

Reference：

1 M. Gallagher, and A. A. Chiba, 'The Amygdala and Emotion', Curr Opin Neurobiol, 6 (1996), 221-7.

2 J. Kim, X. Zhang, S. Muralidhar, S. A. LeBlanc, and S. Tonegawa, 'Basolateral to Central Amygdala Neural Circuits for Appetitive Behaviors', Neuron, 93 (2017), 1464-79 e5.

3 L. W. Swanson, and G. D. Petrovich, 'What Is the Amygdala?', Trends Neurosci, 21 (1998), 323-31.