仪器网（yiqi.com）欢迎您！

不知不觉

「“沃”的实验」之安全高效

动物手术造模全攻略栏目

已到尾声啦！

五大动物手术与造模解决方案

数十种动物造模实验SOP

都已悉数亮相

第一期麻醉定位造模实验

与精彩答题PK中奖活动

第二期创伤性颅脑损伤造模实验

与疑难点揭示

第三期动物麻醉造模实验

与动物福利之间博弈思考

第四期动物给药造模实验中

不同动物给药实验分类展示

第五期线栓法

构建局灶性脑缺血模型实验详解

五期满满详细内容干货

是宝们顺利推进实验的有效利器

五期步步流程清晰讲解

是小沃与宝们的珍贵实操经历

小沃由衷希望我的科研宝们

能够在山重水复疑无路的时候

轻而易举地寻找到

柳暗花明又一村的灯塔

在衣带渐宽终不悔的奋斗中

最终收获

那人就在灯火阑珊处的

释然与宽慰

忙于实验的科研宝们

可能还来不及

将过往5期干货一一收藏

贴心的小沃

今天就为你们全部打包

满满实验干货尽数奉上

让宝们动物造模实验再也不犯难

扫描二维码，一键下载

虽然我们的

安全高效

动物手术造模全攻略栏目结束啦

但是我们「“沃”的实验」

一直在线，接下来

大动物神经系统疾病手术造模protocol

将重磅推出，敬请期待

科研宝们可以随时

关注我们，实时获取

专业的科研实验基础知识和技能

科研实验经验总结

系统丰富的实验学习资料

如果还想获得更多其他实验信息

可在公众号后台留言

小沃将会收取宝们的问题和意见

适时为大家答疑解惑

我们不见不散

下次再见将更精彩

各位小伙伴们，好久不见呀~~

春节长假在我们恋恋不舍的目光中绝尘而去！！

当时的“节后再说”有多爽

现在的开工就有多吐血

面对那一茬接一茬的实验

和一脸呆萌的自己，是不是很崩溃？

别担心~~

贴心的小沃已经准备好复工礼包

本次小沃为你准备了5本动物手术造模手册，无论你是想找神经系统、还是心血管疾病、亦或是肿瘤疾病造模实验方案，这里统统都有，一次性全面系统帮你解答手术实验疑难点。

识别下方二维码，即可免 fei 领 取

（悄悄告诉你，一次可以领取5本噢！）

01

神经系统研究

神经系统研究手术与造模大全囊括了神经科学领域最常使用的动物实验操作技术以及动物模型构建的方法，具体内容包括相关疾病的研究背景、模型构建的操作和评估方法以及参考文献，为您提供规范的实验操作流程和更多的模型选择，提高实验的成功率和可重复性，助您实验顺利开展。

02

心脑血管疾病研究

本手册详细介绍四大疾病模型，包括高血压、脑卒中、动脉粥样硬化、下肢缺血动物疾病模型，构建方法多达17种，助你开拓科研新思路！

03

肿瘤类疾病研究

这本手册涵盖7大肿瘤疾病模型和15种构建方法，概述了不同模型应用场景、优缺点、使用时应考虑的因素等内容，为您提供更多的动物模型参考和更适合的模型选择。

04

代谢类疾病研究

该手册涵盖常见的脂肪肝模型、1型和2型糖尿病模型、肥胖疾病模型的构建与评估方法；详细介绍了不同模型的应用场景、优缺点、使用时应考虑的因素等内容，助你快速找到合适的代谢类实验模型！

05

呼吸系统疾病研究

此手册涵盖哮喘、慢阻肺、急性肺损伤、肺动脉高压、肺纤维化等五大呼吸系统常见疾病的造模及评估方法；以及详实的实验步骤如材料和试剂、设备、操作流程等，为您提供规范完整的实验操作方法。

手册在手，造模我有

赶紧扫描上方二维码免fei领~

人类的悲欢并不相通

实验小白的“忧桑”无人能懂

辛苦找文献，查文献，看文献

众里寻它千百度

埋头查知网，翻教材，做攻略

实验一来两眼空

文献方法笼统太粗略

求助导师不敢开口

动物给药手术实验还没开始就 BE？

4大应用场景分类展示

清晰展示不同动物给药手术实验的每一个流程

手把手教你，一步步进行规范标准化实验操作

轻松种草动物给药手术成功秘籍！

秋风送爽，新的学期开始了。

新学期，新征程，让我们继续努力，为美好未来奋斗。

柏恒科技懂大家之所想，我们携多款PCR仪给大家送福利啦！

话不多说，来看看我们的福利吧！

1. 活动期间凡购买柏恒科技PCR仪等，可获赠实验大礼包，参与活动仪器清单见活动单页；
2. 采购不同的仪器，获得不同的大礼包组合；
3. 活动时间：2021年9月10日-2021年10月31日；
4. 参与对象：购买产品的高校科研用户。

备注：购买时间以合同签订时间为准，礼包在活动结束一周内统一发放。
本活动最终解释权归柏恒科技所有。

仪器推荐

我们即将上新的全自动核酸提取仪（下图一，型号BGNA-32P）是一种可以为生物实验室和临床医学等部门提供安全且效率高的核酸提取、纯化的自动化仪器。目前我们的全自动核酸提取仪正在仪器火热预定中，有想申请的客户可以联系我们代理商或者业务员。

另外我们的实时荧光定量PCR仪Q3200（下图二），是一款便携式荧光定量PCR仪，设备采用四通道双16孔模块设计，可实现一机多用。

更多实验室常用且经常采购仪器，如智能二维梯度PCR仪、三槽梯度PCR仪以及其它各类经济型PCR仪等，欢迎访问我们的官网www.bio-gener.com查看，或者联系柏恒科技的技术支持人员，我们会为您提供专业、及时的技术支持与服务。

 关于柏恒科技

    杭州柏恒科技有限公司成立于2009年，是一家集研发，生产，销售及服务于一体的国家高新技术企业。公司十余年以来一直专注于分子生物实验室设备，主营产品有实时荧光定量PCR仪，等温荧光PCR仪，定性梯度PCR仪，全自动PCR仪，全自动核酸提取仪以及相关配套产品。

    公司秉承一贯的质量方针:质量创品牌，品牌促发展，创新赢未来！严格控制质量，积极拓展品牌，开放思维创新，来打造更优质的产品，更专业的团队，更先进的技术，以始于产品而不止于产品的意识，来服务用户，建设品牌形象，推动行业发展。

4月24日，世界实验动物日

尊重和善待实验动物

维护实验动物福利和伦理

遵循3R（替代、减少和优化）原则

规范和合理地使用实验动物

是我们实验人的义务和责任

在无可避免的动物实验中

动物麻醉

是动物福利和伦理的直接体现

也是动物实验顺利进行的先决条件

动物麻醉好多种，你更pick哪一种？

目前，注射麻醉

如戊 巴 比妥钠、水合氯醛、乌拉坦、氯 胺 酮

在我国的动物麻醉中最为普遍

但在发达国家

气体吸入式麻醉却非常普遍

给予动物最佳的麻醉条件

是对动物在实验过程中最佳的保护

“沃”的实验 栏目

之安全高效动物手术造模全攻略

第三期《动物麻醉手术标准操作流程指引》

详尽为大家讲述不同动物麻醉手术标准操作流程

▼▼▼▼

点击图片下载

用最合情合理合适的麻醉方式

给予动物在实验中最优待的关怀

需要实验室的我们谨慎而为！

春暖花开，

不负韶华！

送别漫长而难忘的寒假，

终于迎来期待已久的返校！

开学在即，您的实验室仪器是否做好准备了呢？梅特勒-托利多特别推出高校“开学大礼包”，帮助老师和同学们确保仪器正常使用，迅速做好开学准备，一键重启教学科研！

那么，就跟小梅一起来看看有哪些礼包吧！

礼包一：久置仪器重启指南    

长假过后，实验室的仪器需要注意哪些开机事项，获取仪器重启指南（获取地址：https://www.mt.com/cn/zh/home/campaigns/product-organizations/lab/2019/cn_lab_campus_tour_2019.html?cmp=smo_wechat）。

•pH 开学知识包

•电导率 开学知识包

•电子天平清洁的8个步骤

•电子天平使用SOP及避免称量误差的建议

•移液器校准与技术

•移液器清洁

礼包二：“小梅课堂” 直播技术交流会    

小梅喊你来上课啦！小梅VIP课堂定期开讲，包括但不限于以下主题哦：

•天平、pH计、移液器等仪器久置开机须知

•天平良好的称量管理规范™（GWP^®）

•pH/电导率使用技巧和日常维护保养

•热分析仪在高校行业的GX应用

•自动化化学仪器在有机合成中的应用

•移液器操作规范

礼包三：免费仪器健康检查    

仪器健康检查主要涵盖梅特勒-托利多天平，pH计/电导率仪，RAININ移液器，滴定仪等仪器。我们专业的服务人员将通过在线指导或线下巡检的方式，确保实验室设备正常运行，并获得准确的测量结果。有需要的同学，让我看到你们的双手！

礼包四：第三届“学泰杯”全国高校有奖论文大赛    

2020年梅特勒-托利多第三届“学泰杯”全国高校有奖论文大赛正在火爆进行中，凡论文中提及梅特勒-托利多实验室任意一款仪器，即可参赛。本次活动有效期将截至2020年11月30日，热烈欢迎各大高校老师和同学们投稿！

*戳图片查看往届回顾

本期彩蛋

为回馈高校师生，深入了解各个学校的实验室需求，帮助高校用户更好地利用实验室仪器与服务，提高实验效率，我们特地开展高校有奖调研活动。本次活动奖品共有66个“哆啦A梦”限量版天猫精灵，感兴趣的同学冲鸭！欢迎大家转发给其他感兴趣的老师或同学。

截止时间：2020年5月31日

活动奖品

“哆啦A梦”限量版

天猫精灵（66个）

*奖品以收到的实物为准

立即识别下方二维码，参加有奖调研，赢取天猫精灵！

*本次活动解释权归梅特勒-托利多所有

实验进展如何？

实验数据有了吗？

动物模型构建没人教？

换课题之后对动物模型构建不了解？

辛辛苦苦建立的动物模型

剔除掉了三分之一甚至一大半？

动物模型构建后该如何评估？

别着急，我们帮你准备了

助你开启实验第 一步

识别下方二维码立刻免 费 领取↓↓

这本手册大全包含什么？

01.神经环路相关研究常用的手术操作

你想要的脑立体定位病毒注射实验、套管埋植实验、光遗传光纤埋植实验、微透析探针埋植实验、在体电生理电极埋植实验等统统都有。实验步骤如材料和试剂、设备、操作流程全都包含。
 

02.神经系统疾病动物造模和评估方法

AD、PD、PTSD、抑郁症、自闭症、颅脑损伤、脊髓损伤、视神经损伤、疼痛等疾病造模与评估方法全部都有。

该动物手术造模大全囊括了神经科学领域最常使用的动物实验操作技术以及动物模型构建的方法，具体内容包括相关疾病的研究背景、模型构建的操作和评估方法以及参考文献，为您提供规范的实验操作流程和更多的模型选择，提高实验的成功率和可重复性，助您实验顺利开展。

不要998，也不要98

统统都不要！！

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抑郁动物模型的造模方法找不对？

实验动物不会选择？

不知道有哪些常用的行为学检测方法？

「全线赋能“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第二期将为大家带来

《抑郁动物模型研究方法》

两位老师为大家详细讲解

造模方法、实验动物选择、行为学检测方法

涵盖常用模型和高频技巧，更有互动答疑

快速帮你摸清抑郁动物模型的构建

直播时间

4月26日（周二）19：00

报名方式

识别上方二维码，立即入群免费报名

直播全程免费，群内专业答疑

上期不少小伙伴在直播间

提出互动问题，这次我们全部讲解

一、实验操作类

1.注射针进入目标脑区后，可以直接进行注射吗？

“确定针头到达目标脑区后，建议停针1min，平衡气压，然后就可以开启注射程序了。”

2.颅钉植入的位置如何选择？

“颅钉的植入位置应该尽量避免血管集中的区域及注射位点。”

3.颅骨调平的标准要求是？

“前囟和后囟高度差，Bregma左右高度差均在±0.03mm以内，即可认为与颅骨水平。”

4.小鼠脑部病毒注射实验需要挑开硬脑膜吗？

“使用较细的玻璃电极注射的时候需要挑开硬脑膜，因为电极尖端较为脆弱，而硬脑膜具有弹性阻力，可能会把尖端弄断。同样道理，在植入多通道电极的时，也需要挑开硬脑膜，防止电极尖端受损。”

5.脑部病毒注射实验中，进针速度需要控制在？

“进针应保持匀速缓慢，推荐将全自动脑立体定位仪的速度设置在0.2-0.5mm/s。”

6.使用脑立体定位仪固定小鼠，耳杆固定位置是？

“一侧耳杆移至适当位置旋紧固定，用手轻柔拖住老鼠头部，将头部同侧枕骨大孔位置对准耳杆尖端，缓慢推动另一侧耳杆至枕骨大孔处。”

7.如何判断病毒正常注射，没有产生针头堵塞等现象？

“在使用注射针连接玻璃电极进行病毒注射时，可以先用空针吸取足够的矿物油起到密封作用，再吸取一定体积的病毒，矿物油的重力作用可以保证病毒注射更为流畅。另外矿物油与病毒之间因为密度不同会出现明显的液面分界线，我们可以用记号笔标记分界线的位置，就可以很直观观察到注射过程中是否存在针头阻塞现象了。”

二、实验耗材类

1.脑立体定位手术中，如何保护小鼠眼睛不受光源伤害？

“固定小鼠之后，可以在小鼠眼周涂抹红霉素眼膏，起到一定的闭光和防感染作用。”

2.光遗传与光纤记录使用的陶瓷插针有区别吗？

“目前常见的陶瓷插针都是使用的石英材质，自发荧光较低，所以可用于光遗传和光纤记录实验。但是光纤记录实验更推荐使用黑色陶瓷插针，可以更好的避免环境光对于信号的干扰。”

3.固定的颅钉需要使用多大尺寸？什么材质？

“小鼠用M1.0，大鼠用M1.4，M1.2介于两者之间，成年小鼠与幼大鼠可用，一般是不锈钢材质。”

4.颅钉的作用是？

“如同盖房子使用的钢筋一样，和牙科水泥一起可以让植入的陶瓷插针等更加牢固。”

三、实验技巧类

1.左右颅骨调平需要旁开多少距离？

“依据个人习惯而定，一般推荐旁开2mm左右（2-2.5mm均可）。”

2.使用牙科水泥固定，是否还需要缝合头皮组织？

“如果备皮环节直接将注射位点上方的头皮直接剪掉，那么直接通过牙科水泥就可以覆盖头部整体创面，不需要在缝合头皮。如果是剪开头皮进行的注射，或者牙科水泥固定的范围较小，可以将周边的头皮进行缝合。”

3．病毒注射完成后，植入陶瓷插针需要重新进行颅骨调平吗？

“在实验中一般不需要二次调平，使用前囟点作为参考0点，那么整体操作过程中就始终保持同一个参考点即可。如果发现更换夹持器或者更换实验器材，导致坐标有较大差别，可能是动物固定不够牢固，需要重新检查固定。”

4.光纤记录实验过程中需要全程避光吗？

“当然不建议强光下进行实验，使用黑色陶瓷插针及黑色陶瓷套管，将动物头部的牙科水泥涂黑即可很好的避免环境光对于实验信号的干扰。同时实验环境前后需要保持一致，避免环境变化导致的数据对比问题。”

5.怎样才能让数据结果更加平滑？

“数据处理过程中可以选择平滑处理功能，同时在数据采集过程中，可以改变相应的参数（如帧率，曝光等）可以让数据呈现的更加好看。”

6.光纤记录中进行光纤漂白的目的是？

“光纤具有一定的自发荧光，这种内部的自发荧光会掩盖一部分微弱的信号。常用光纤根据材质分为普通光纤和低自发荧光光纤，普通光纤进行光纤记录实验前必须进行漂白。”

7.本底信号波动的产生原因？

“实验环境的不稳定（温度，光线等），动物状态都有可能导致本底信号波动。使用黑色陶瓷插针及黑色陶瓷套管，将动物头部的牙科水泥涂黑可以很好的避免环境光对于实验信号的干扰。”

8.神经递质探针信号与钙信号有什么差别？

“常见钙信号会呈现出快速上升和缓慢下降的特征峰形，而递质类信号因为信号周期较长，上升或下降都可能需要较长的时间，所以信号较为平缓。但是不同脑区及种类细胞的钙信号差别较大，具体实验会有不同。（参考下面图片——经典钙信号状态）。”

四、实验仪器类

1.光纤记录数据分析软件需要单独安装吗？

“不需要，R820光纤记录软件包含数据采集功能和数据分析功能，通过一个软件即可实现采集和分析，简化实验步骤，提高实验效率。”

2.夹持玻璃电极的注射仪器是？

“R480玻璃微电极注射泵，可用于细胞、胚胎、颅脑等纳升级显微注射。”

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进群还可轻松获取后续科研直播课信息

以及更多丰富学术干货~

上一期《神经系统研究手术造模手册大全》发布以来广受一线科研工作者的好评，现在“沃”的实验第二弹《呼吸系统研究手术造模手册大全》终于新鲜出炉啦！

作为一线的科研人，往往都要做动物实验，有时高分科研paper也离不开动物实验的支撑。你是否还在为动物实验手术操作而犯愁：

• 给药、埋置等操作比较繁杂，稍不留意就会功亏一篑？

• 只会皮下注射，其他腹腔、鞘内、肌肉注射给药技术都没操作过？

• 颅脑损伤实验，老鼠颅骨不好固定？

• 查阅大量文献，实际手术操作还是不会做？

• 没人指导，实验一拖再拖？

「“沃”的实验」——全网最全的生命科学研究线上学习平台第三期，为大家分享实验动物手术操作方法，涵盖12种手术操作技术/4大手术操作实验/10大视频课程，带你轻松熟悉注射给药、手术埋置、颅脑/脊髓损伤和缓释泵植入等实验，加速你的实验进程，助你paper连连。

>动物注射给药技术

• 腹腔注射

• 皮下注射

• 肌肉注射

• 尾静脉注射

• 鞘内注射

>动物手术埋植实验

• 立体定位注射/插针埋置实验操作

• 电极埋植手术操作

• 给药套管埋植手术操作

• 脑组织移除及透镜植入实验操作

 >颅脑/脊髓损伤实验 

• 颅脑损伤实验操作

• 脊髓横断实验操作

>缓释泵植入实验

• 植入式缓释泵概述

• 缓释泵植入实验操作

涵盖科研基础知识、实验技能、经验总结

囊括视频课程、实验手册、SOP流程图……

“沃”的实验线上学习平台将陆续上线，包含常见疾病动物模型、实验动物手术操作、实验动物行为评估、神经信号研究、细胞与分子研究……陪你走过整个学期，一站式助你提升科研技能

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光纤记录系统作为常用的研究动物神经元活动与行为关系的重要工具，对于研究特定神经环路在不同行为范式中的功能具有重要意义。本文将着重介绍光纤记录实验手术所需器材，手术步骤以及注意事项，助力实验数据准确性的提升。

实验设备和材料

异氟烷麻醉系统、立体定位仪、数码显微镜、电极拉制仪、微量注射泵、剃毛工具、手术刀、眼科镊、眼科剪、棉签、碘伏、3%双氧水，AAV病毒、陶瓷插针、颅骨钻、钻头（0.8mm）、颅钉（M1.0xL2.0mm）、螺丝刀（45*1mm）、生理盐水、牙托粉水（义齿基托聚合物，自凝型）、红霉素眼膏、抗生素等。

术前准备

01

确定目标脑区坐标

确定目标脑区位点通常有两种策略：

• 通过使用立体定位图谱，寻找目标脑区具体位置，读取目标脑区深度，矢状、冠状坐标，最终确定目标脑区的三维坐标。

• 通过阅读参考文献，获取方法中涉及目标脑区的坐标。文献中坐标常用标注：AP：anteroposterior，前囟前后；ML：mediolateral，中缝左右；DV：dorsoventral，颅骨（硬脑膜）平面向下。

*需要注意：文献中坐标选取的Z轴参考点：包括Bregma点、脑膜表面、颅骨表面的Z轴读值

02

器具消毒、仪器检查

实验前使用酒精擦拭手术器械，检查各种实验耗材是否准备完整。检查立体定位仪，确保定位仪刻度置零，可以正常工作。

03

实验动物准备

选取实验动物检查其健康状况。

（▲小鼠颅骨表面示意图）

动物手术

01

动物麻醉及固定

1. 小鼠称重。

2. 在异氟烷诱导盒中麻醉小鼠（4％，1 L / min）。

3. 将小鼠嘴部放在麻醉面罩中。

4. 将小鼠门齿扣在适配器齿棒上，并使用适配器将小鼠固定于立体定位仪上，异氟烷浓度调整为0.5-1%。

5. 麻醉深度可通过对脚趾捏合无反应（监测脚趾捏合反应）来确认，手术期间每20min一次。

6. 剃掉从眼睛到耳朵后面的毛发。

7. 用棉签蘸少量碘伏清洁头部。

8. 在头皮表面下注入0.1 ml利多卡因，以提供局部镇痛作用。

9. 保护眼睛避光：涂抹红霉素眼膏。

（▲手术前小鼠）

02

暴露颅骨

1. 从前到后（眼睛之间到颅骨后部）做切口。

2. 用蘸有生理盐水的棉签擦拭切口。

3. 找到并标记Bregma（前囟点）位置。

4. 确保头骨干净（没有血液，毛皮或组织）并且干燥（使用干燥的棉签吸生理盐水或血液）。

5. 将连接好玻璃电极的微量注射泵夹持到定位仪上。

6. 调节颅骨水平：玻璃电极针尖接触Bregma点，将该点设定为原点，而后测量Bregma点左右两侧旁开2.3mm处颅骨的高度差，小于0.03mm则认为左右颅骨水平，大于0.03mm则需要调节耳杆的高度来调整水平，前后方向测量Bregma点和Lambda点的高度差，也需小于0.03mm，若大于0.03mm则上下调整鼻夹的高度（注意：移动颅骨后需要重新定Bregma点）。

7. 标记目标位置。

8. 在目标标记点处用颅钻进行开颅并挑开硬脑膜。此外还需钻两个预留孔，用于埋植颅钉。如果钻孔过程发生出血，使用棉签清洁血液，然后使用一块可吸收的海绵来止血。

9. 用盐水浸湿的海绵覆盖开颅部位。

03

病毒注射

1. 从冰箱中取出病毒。

2. 设置微量注射泵参数（例如吸取体积400nL，速度为800nL/min，模式调为吸入Withdraw）吸取病毒，使其尖端接触Bregma点并设定原点。

3. 取走开颅部位湿海绵。

4. 将玻璃电极针移动至目标位点上方，然后下针至目标位点（下针过程保持匀速缓慢），设置注射泵参数（体积400nL，速度40nL/min，模式调为泵出Infuse）,开始注射病毒。

5. 注射完成后静置10min，10min后将微量注射器抬起。

6. 瑞沃德R480玻璃微电极注射泵搭配立体定位仪，对脑部可精准进行病毒或示踪剂注射。

04

埋植颅钉

颅钉（小螺丝）植入深度约0.5mm左右，避免过深压迫大脑，过浅固定不牢固。固定颅钉的预留孔需离光纤埋植的位置远一些，防止颅钉埋好之后留下的空间太小，导致光纤不好埋植。颅骨钻孔完成后，还需清理颅骨表面的颅骨碎屑，并用生理盐水清洗，保证颅骨表面清晰干净。

（▲颅钉植入）

05

陶瓷插针植入

1. 在病毒注射后，从脑立体定位仪上取下注射泵。

2. 将光纤插针用夹持器固定到脑立体定位仪上。

3. 固定光纤之后需要用光纤尖部接触Bregma点，重新移动至目标位点上方（光纤插针应位于钻头产生的窗口上方）。

4. 将光纤插针下降到适当的DV坐标，高于病毒注射位置200-300μm。

5. 用牙科水泥固定光纤。注意：牙科水泥轻轻涂抹在光纤纤维的底部周围。

6. 待水泥完全凝固后，小鼠转移至饲养笼中单独饲养，术后监测健康情况。

光纤记录实验

待2-3周钙荧光病毒表达后，将光纤与小鼠头部陶瓷插针连接，使用光纤记录系统采集动物在行为学实验中大脑的钙荧光信号，通过分析软件处理钙荧光信号数据，并结合行为学视频对动物的行为进行分析。

（▲光纤记录实验）

光纤记录实验手术中所需器材、手术步骤和注意事项已全部讲解，后续我们还有更多光纤记录干货，请持续关注哦~

R820三色多通道光纤记录系统

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下次做麻醉定位手术不要再走弯路咯~~

∨

下一期“沃的实验”之

“安全高效动物手术造模全攻略”

将给大家带来

颅脑损伤实验相关流程SOP

敬请期待！！！

硝基咪唑类药物（nitroimidazole,NMZs）是一类具有抗原虫感染和抗厌氧菌的硝基杂环类KJ药物，其具有kangjun和抗原虫作用。近年来作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产中，同时也是一种生长促进剂，以促进畜禽的生长及改善饲料的转换率。由于这类化合物含有的硝基杂环类物质具有潜在致癌、致畸和致突变作用，因此欧美等发达国家已禁止在食源性动物中使用硝基咪唑类药物。我国也对硝基咪唑类药物进行了严格的限制，2020年生效实施的GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药ZD残留限量》中仅规定了甲硝唑和地美硝唑两种物质允许作ZL使用，但不得在动物性食品中检出；同年农业农村部公告第250号，将洛硝达唑、替硝唑列入《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中。

本文阐述了如何将硝基咪唑类化合物从样品基质中分离提取出来，并经过净化后，转化成液质联用仪可以检测的形式。以提取、净化为ZD，依据国标GB/T 21318-2007，为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。

应用范围

猪肉/鸡肉/牛肉/猪肝/鸡肝/牛肝/猪肾/牛肾/鱼肉/奶粉/蜂蜜

方法原理

样品中残留的8种硝基咪唑、2种代谢物用甲醇-丙酮均质或超声波提取，经乙酸乙酯液液分配，以凝胶色谱（GPC）净化，再经固相萃取（SPE）净化，采用液相色谱/串联质谱确证，外标法定量测定。

前处理仪器

凝胶色谱仪（配有馏份收集浓缩器）；组织捣碎机；均质器；超声波发生器；旋转蒸发器；高速离心机；氮吹仪；固相萃取装置；具塞锥形瓶（250 mL）；分液漏斗（250 mL）；浓缩瓶（50 mL、250 mL）。

检测仪器：LC-MS/MS+ESI源

01提取

肌肉组织、脏器组织样品及水产品准确称取约20 g样品（精确至0.1 g）于250 mL具塞锥形瓶中，加入10 g硅藻土（80目～120目）与样品充分混匀，再依次加入5 mL饱和氯化钠水溶液和70 mL甲醇-丙酮（3+1），高速均质提取3 min。将提取液移入离心管中，于10000 r/min离心2 min，将上层提取液移入250 mL浓缩瓶中。残渣每次再用50 mL甲醇-丙酮（3+1）重复提取两次，合并提取液。

蜂蜜、乳及乳制品样品准确称取约20 g样品（精确至0.1 g）于250 mL具塞锥形瓶中，加入10 mL饱和氯化钠水溶液和70 mL甲醇-丙酮（3+1），超声波提取30 min。移入离心管中，于10000 r/min离心2 min，将上层提取液移入250 mL浓缩瓶中。残渣每次再用50 mL甲醇-丙酮（3+1）重复提取两次，合并提取液。

02液液分配

将提取液于40 ℃水浴中旋转浓缩至只剩水相，并转移至250 mL分液漏斗中，加入50 mL饱和氯化钠水溶液和25 mL乙酸乙酯，振摇3 min，静置分层，收集乙酸乙酯相。水相再用20 mL乙酸乙酯重复提取两次，合并乙酸乙酯相。经无水硫酸钠柱脱水，收集于250 mL浓缩瓶中，于40 ℃水浴中旋转浓缩至近干，加入5 mL乙酸乙酯-环己烷（1+1）溶解残渣，并用0.45 μm滤膜过滤，待净化。

03净化

凝胶色谱（GPC）净化凝胶色谱净化条件如下：净化柱：700 mm×25 mm，Bio Bcads S X3，或相当者；流动相：乙酸乙酯-环己烷（1+1）；流速：4.7 mL/min；样品定量环：5.0 mL；预淋洗体积：50 mL；洗脱总体积：210 mL；开始弃去体积：90 mL；收集体积：90 mL；ZH弃去体积：30 mL。

04凝胶色谱净化步骤如下

将5 mL待净化液按照凝胶色谱净化条件进行净化，合并馏份收集器中的收集液于250 mL浓缩瓶中，于40 ℃水浴中旋转浓缩至近干，加入5 mL甲醇以溶解残渣，待净化。

05固相萃取（SPE）净化

使用前用5 mL甲醇预淋洗C18固相萃取柱（1 g，6 mL），将5 mL溶解液倾入C18固相萃取柱中，以1 mL/min的速度收集流出液，再用10 mL甲醇进行洗脱。收集全部洗脱液于50 mL浓缩瓶中，于40 ℃水浴中旋转浓缩至干。用甲醇溶解并定容至1.0 mL，经0.45 μm滤膜过滤后，供液质测定和确证。

国标解读及注意事项

1.硝基咪唑标准物质用甲醇配成1000 μg/mL的标准储备液，在0 ～4 ℃条件下避光保存，可使用12个月。2.如果有条件，建议凝胶色谱净化系统中配合使用紫外检测器，准确监测目标化合物及杂质的流出情况。

3.固相萃取净化过程中，C18柱作为净化柱使用，注意上样过程中就需要收集流出液，再和洗脱液进行合并。

4.国标方法中使用基质添加标准曲线，外标法进行回收率的校正。注意做肉类样品的基质添加标准曲线前，先进行洗涤，然后加标，再进行后续提取净化等流程。

5.建议使用硝基咪唑标准物质相对应的同位素内标，进行回收率的校正。

参考文献：GB/T 21318-2007 动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法

图1 肌肉组织、脏器组织样品及水产品中硝基咪唑残留量测定的前处理流程图

图2 蜂蜜、乳及乳制品样品中硝基咪唑残留量测定的前处理流程图

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　　实验干货—ELISA实验过程中的常见问题解答
 

　　ELISA实验中会遇到很多问题，不是这有点小问题，就是那有点小问题，那该怎么办呢?以下便是天津本生技术小编是我们在多年的实验过程中遇到问题的总结：

　　Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色

　　溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定。

　　Q2.标曲和样本均不显色

　　在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱，推荐孵育阶段，使用ELISA用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，结合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

　　Q3.标曲显色，样本不显色

　　当样本中目的蛋白浓度低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目ELISA仍然是蛋白检测灵敏度的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。

　　对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

　　Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大

　　这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大;实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

　　掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。

　　Q5.本底偏高，样本值测不到

　　标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。

　　在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。

　　Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大

　　有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后，计算得到的样本值之间差异较大，应该选择哪一个稀释倍数呢?

　　这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时，血清中的各种蛋白会抗原抗体的接触，基质效应较明显。而经过稀释后，干扰因素也随之稀释，影响就会较小。当某两个梯度稀释后，计算得到的样本值接近时，我们就可以认为在该稀释梯度时，样本中的干扰因素影响较小，计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本，经过多倍稀释后，就更加测不到了，此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。

　　Q7.不同试剂盒中的组分能否通用

　　除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液，其它组分不建议用其它试剂盒的组分，甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的，如果贸然使用其它试剂盒的组分，有可能对结果产生影响。

　　ELISA试剂盒本生公司产品种类已超过万种，正广泛应用于科研院校、中心实验室、分子生物学等科研域。公司丰富的产品既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求，也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。