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抑郁动物模型的造模方法找不对？

实验动物不会选择？

不知道有哪些常用的行为学检测方法？

「全线赋能“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第二期将为大家带来

《抑郁动物模型研究方法》

两位老师为大家详细讲解

造模方法、实验动物选择、行为学检测方法

涵盖常用模型和高频技巧，更有互动答疑

快速帮你摸清抑郁动物模型的构建

直播时间

4月26日（周二）19：00

报名方式

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直播全程免费，群内专业答疑

上期不少小伙伴在直播间

提出互动问题，这次我们全部讲解

一、实验操作类

1.注射针进入目标脑区后，可以直接进行注射吗？

“确定针头到达目标脑区后，建议停针1min，平衡气压，然后就可以开启注射程序了。”

2.颅钉植入的位置如何选择？

“颅钉的植入位置应该尽量避免血管集中的区域及注射位点。”

3.颅骨调平的标准要求是？

“前囟和后囟高度差，Bregma左右高度差均在±0.03mm以内，即可认为与颅骨水平。”

4.小鼠脑部病毒注射实验需要挑开硬脑膜吗？

“使用较细的玻璃电极注射的时候需要挑开硬脑膜，因为电极尖端较为脆弱，而硬脑膜具有弹性阻力，可能会把尖端弄断。同样道理，在植入多通道电极的时，也需要挑开硬脑膜，防止电极尖端受损。”

5.脑部病毒注射实验中，进针速度需要控制在？

“进针应保持匀速缓慢，推荐将全自动脑立体定位仪的速度设置在0.2-0.5mm/s。”

6.使用脑立体定位仪固定小鼠，耳杆固定位置是？

“一侧耳杆移至适当位置旋紧固定，用手轻柔拖住老鼠头部，将头部同侧枕骨大孔位置对准耳杆尖端，缓慢推动另一侧耳杆至枕骨大孔处。”

7.如何判断病毒正常注射，没有产生针头堵塞等现象？

“在使用注射针连接玻璃电极进行病毒注射时，可以先用空针吸取足够的矿物油起到密封作用，再吸取一定体积的病毒，矿物油的重力作用可以保证病毒注射更为流畅。另外矿物油与病毒之间因为密度不同会出现明显的液面分界线，我们可以用记号笔标记分界线的位置，就可以很直观观察到注射过程中是否存在针头阻塞现象了。”

二、实验耗材类

1.脑立体定位手术中，如何保护小鼠眼睛不受光源伤害？

“固定小鼠之后，可以在小鼠眼周涂抹红霉素眼膏，起到一定的闭光和防感染作用。”

2.光遗传与光纤记录使用的陶瓷插针有区别吗？

“目前常见的陶瓷插针都是使用的石英材质，自发荧光较低，所以可用于光遗传和光纤记录实验。但是光纤记录实验更推荐使用黑色陶瓷插针，可以更好的避免环境光对于信号的干扰。”

3.固定的颅钉需要使用多大尺寸？什么材质？

“小鼠用M1.0，大鼠用M1.4，M1.2介于两者之间，成年小鼠与幼大鼠可用，一般是不锈钢材质。”

4.颅钉的作用是？

“如同盖房子使用的钢筋一样，和牙科水泥一起可以让植入的陶瓷插针等更加牢固。”

三、实验技巧类

1.左右颅骨调平需要旁开多少距离？

“依据个人习惯而定，一般推荐旁开2mm左右（2-2.5mm均可）。”

2.使用牙科水泥固定，是否还需要缝合头皮组织？

“如果备皮环节直接将注射位点上方的头皮直接剪掉，那么直接通过牙科水泥就可以覆盖头部整体创面，不需要在缝合头皮。如果是剪开头皮进行的注射，或者牙科水泥固定的范围较小，可以将周边的头皮进行缝合。”

3．病毒注射完成后，植入陶瓷插针需要重新进行颅骨调平吗？

“在实验中一般不需要二次调平，使用前囟点作为参考0点，那么整体操作过程中就始终保持同一个参考点即可。如果发现更换夹持器或者更换实验器材，导致坐标有较大差别，可能是动物固定不够牢固，需要重新检查固定。”

4.光纤记录实验过程中需要全程避光吗？

“当然不建议强光下进行实验，使用黑色陶瓷插针及黑色陶瓷套管，将动物头部的牙科水泥涂黑即可很好的避免环境光对于实验信号的干扰。同时实验环境前后需要保持一致，避免环境变化导致的数据对比问题。”

5.怎样才能让数据结果更加平滑？

“数据处理过程中可以选择平滑处理功能，同时在数据采集过程中，可以改变相应的参数（如帧率，曝光等）可以让数据呈现的更加好看。”

6.光纤记录中进行光纤漂白的目的是？

“光纤具有一定的自发荧光，这种内部的自发荧光会掩盖一部分微弱的信号。常用光纤根据材质分为普通光纤和低自发荧光光纤，普通光纤进行光纤记录实验前必须进行漂白。”

7.本底信号波动的产生原因？

“实验环境的不稳定（温度，光线等），动物状态都有可能导致本底信号波动。使用黑色陶瓷插针及黑色陶瓷套管，将动物头部的牙科水泥涂黑可以很好的避免环境光对于实验信号的干扰。”

8.神经递质探针信号与钙信号有什么差别？

“常见钙信号会呈现出快速上升和缓慢下降的特征峰形，而递质类信号因为信号周期较长，上升或下降都可能需要较长的时间，所以信号较为平缓。但是不同脑区及种类细胞的钙信号差别较大，具体实验会有不同。（参考下面图片——经典钙信号状态）。”

四、实验仪器类

1.光纤记录数据分析软件需要单独安装吗？

“不需要，R820光纤记录软件包含数据采集功能和数据分析功能，通过一个软件即可实现采集和分析，简化实验步骤，提高实验效率。”

2.夹持玻璃电极的注射仪器是？

“R480玻璃微电极注射泵，可用于细胞、胚胎、颅脑等纳升级显微注射。”

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上一期《神经系统研究手术造模手册大全》发布以来广受一线科研工作者的好评，现在“沃”的实验第二弹《呼吸系统研究手术造模手册大全》终于新鲜出炉啦！

不知不觉

「“沃”的实验」之安全高效

动物手术造模全攻略栏目

已到尾声啦！

五大动物手术与造模解决方案

数十种动物造模实验SOP

都已悉数亮相

第一期麻醉定位造模实验

与精彩答题PK中奖活动

第二期创伤性颅脑损伤造模实验

与疑难点揭示

第三期动物麻醉造模实验

与动物福利之间博弈思考

第四期动物给药造模实验中

不同动物给药实验分类展示

第五期线栓法

构建局灶性脑缺血模型实验详解

五期满满详细内容干货

是宝们顺利推进实验的有效利器

五期步步流程清晰讲解

是小沃与宝们的珍贵实操经历

小沃由衷希望我的科研宝们

能够在山重水复疑无路的时候

轻而易举地寻找到

柳暗花明又一村的灯塔

在衣带渐宽终不悔的奋斗中

最终收获

那人就在灯火阑珊处的

释然与宽慰

忙于实验的科研宝们

可能还来不及

将过往5期干货一一收藏

贴心的小沃

今天就为你们全部打包

满满实验干货尽数奉上

让宝们动物造模实验再也不犯难

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虽然我们的

安全高效

动物手术造模全攻略栏目结束啦

但是我们「“沃”的实验」

一直在线，接下来

大动物神经系统疾病手术造模protocol

将重磅推出，敬请期待

科研宝们可以随时

关注我们，实时获取

专业的科研实验基础知识和技能

科研实验经验总结

系统丰富的实验学习资料

如果还想获得更多其他实验信息

可在公众号后台留言

小沃将会收取宝们的问题和意见

适时为大家答疑解惑

我们不见不散

下次再见将更精彩

各位小伙伴们，好久不见呀~~

春节长假在我们恋恋不舍的目光中绝尘而去！！

当时的“节后再说”有多爽

现在的开工就有多吐血

面对那一茬接一茬的实验

和一脸呆萌的自己，是不是很崩溃？

别担心~~

贴心的小沃已经准备好复工礼包

本次小沃为你准备了5本动物手术造模手册，无论你是想找神经系统、还是心血管疾病、亦或是肿瘤疾病造模实验方案，这里统统都有，一次性全面系统帮你解答手术实验疑难点。

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（悄悄告诉你，一次可以领取5本噢！）

01

神经系统研究

神经系统研究手术与造模大全囊括了神经科学领域最常使用的动物实验操作技术以及动物模型构建的方法，具体内容包括相关疾病的研究背景、模型构建的操作和评估方法以及参考文献，为您提供规范的实验操作流程和更多的模型选择，提高实验的成功率和可重复性，助您实验顺利开展。

02

心脑血管疾病研究

本手册详细介绍四大疾病模型，包括高血压、脑卒中、动脉粥样硬化、下肢缺血动物疾病模型，构建方法多达17种，助你开拓科研新思路！

03

肿瘤类疾病研究

这本手册涵盖7大肿瘤疾病模型和15种构建方法，概述了不同模型应用场景、优缺点、使用时应考虑的因素等内容，为您提供更多的动物模型参考和更适合的模型选择。

04

代谢类疾病研究

该手册涵盖常见的脂肪肝模型、1型和2型糖尿病模型、肥胖疾病模型的构建与评估方法；详细介绍了不同模型的应用场景、优缺点、使用时应考虑的因素等内容，助你快速找到合适的代谢类实验模型！

05

呼吸系统疾病研究

此手册涵盖哮喘、慢阻肺、急性肺损伤、肺动脉高压、肺纤维化等五大呼吸系统常见疾病的造模及评估方法；以及详实的实验步骤如材料和试剂、设备、操作流程等，为您提供规范完整的实验操作方法。

手册在手，造模我有

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实验进展如何？

实验数据有了吗？

动物模型构建没人教？

换课题之后对动物模型构建不了解？

辛辛苦苦建立的动物模型

剔除掉了三分之一甚至一大半？

动物模型构建后该如何评估？

别着急，我们帮你准备了

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这本手册大全包含什么？

01.神经环路相关研究常用的手术操作

你想要的脑立体定位病毒注射实验、套管埋植实验、光遗传光纤埋植实验、微透析探针埋植实验、在体电生理电极埋植实验等统统都有。实验步骤如材料和试剂、设备、操作流程全都包含。
 

02.神经系统疾病动物造模和评估方法

AD、PD、PTSD、抑郁症、自闭症、颅脑损伤、脊髓损伤、视神经损伤、疼痛等疾病造模与评估方法全部都有。

该动物手术造模大全囊括了神经科学领域最常使用的动物实验操作技术以及动物模型构建的方法，具体内容包括相关疾病的研究背景、模型构建的操作和评估方法以及参考文献，为您提供规范的实验操作流程和更多的模型选择，提高实验的成功率和可重复性，助您实验顺利开展。

不要998，也不要98

统统都不要！！

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在做基础研究时加入动物实验不仅会使研究工作更完善，也会提高投稿的命中率，但是想把实验做成功却不是件容易的事儿，因为在动物造模中总遇到各种难题：

• 搞不清动物建模标准化的流程，做起实验磕磕绊绊

• 造模需要注意的细节多，反复摸索十几遍才造模成功

• 明明按照文献中的实验方法造模，却还老是不成功

“沃”的实验

全网最全的生命科学研究线上学习平台

第二期内容：

常见疾病动物模型——构建方法系列2

帮助大家解决造模中遇到的难题

“沃”的实验——全网最全的生命科学研究线上学习平台第二期内容，为大家分享常见疾病动物模型构建方法，涵盖8大视频课程+2大实验手册+3大建模的标准操作流程。

5位老师线上为你讲解不同动物模型的背景、造模方法等内容，理论结合实践，希望能给大家的动物建模带来更多新思路和新灵感。

  8大视频课程

  2大实验手册

  3大建模的标准操作流程

欢迎大家收藏「“沃”的实验」线上学习平台

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下期内容预告：

 实验动物手术操作-手术方法 

饮食正是影响肠道微生物群组成的主要因素之一，因此饮食如何通过微生物群来影响大脑健康和精神疾病，也受到了很多研究的关注。

日前，西班牙赫罗纳生物医学研究所（IDIBGI）的一支研究团队，在人类以及果蝇、小鼠等多个物种中证明，抑郁的严重程度与血液中一种常见氨基酸——脯氨酸（proline）含量升高显著相关，而血液中的脯氨酸水平则取决于饮食以及肠道微生物的组成与代谢活性。

研究结果发表在《细胞》旗下子刊Cell Metabolism上。伦敦国王学院（King’s College London）的代谢专家Sandrine Claus教授评论说：“据我所知，这是***次有研究团队真正证明，脯氨酸摄入量与抑郁行为之间存在因果关系。”

研究人员从一份调查食物摄入频率的问卷中注意到了脯氨酸。这份问卷调查包含人们日常摄入的80项食物，涉及各种膳食营养素。研究人员将数十名参与者的问卷调查结果与他们的抑郁症评估得分进行了比较。结果显示，各项膳食营养素中，脯氨酸与抑郁特征的关联***为明显。

在对参与者进行血液检测后，结果同样显示，血液循环中的脯氨酸含量与抑郁严重程度显著相关。那些膳食脯氨酸摄入量高且血液脯氨酸高于中位数的受试者，抑郁评分***高。

“我们发现，不仅是在重性抑郁中，在中性抑郁患者中也可以看到脯氨酸循环含量升高的现象。”研究人员强调。

然而，研究人员敏锐地注意到数据中有些不一致的地方。简单来说，通过饮食摄入脯氨酸同样多的人，血浆的脯氨酸水平并没有全都升高。

在对这些参与者的血液和粪便样本进行多组学分析后，研究人员找到了解释：血浆脯氨酸水平与特定几种肠道细菌（例如某些乳酸杆菌属的细菌）的存在及其活性有关。摄入的脯氨酸量相同，但血液循环中的脯氨酸含量有差异的个体，肠道菌群的组成不同，而其中脯氨酸较高的人，肠道菌群的组成特征与较严重的抑郁症密切相关。

▲该研究示意图

脯氨酸与抑郁症之间的联系在后续的动物实验中得到了进一步验证。研究人员给一些小鼠的饮食中额外添加了脯氨酸补充剂，一段时间后，这些小鼠的脯氨酸循环含量高于普通饮食的小鼠，而它们在承受压力时，也会比对照组小鼠表现出更多的类似抑郁的行为，例如不再对好喝的糖水感兴趣。

小鼠实验还显示了肠道菌群在其中起到的重要作用。研究人员从20名人类志愿者中获取了粪便样本，通过粪便移植将其中的肠道菌群植入无菌小鼠体内。这些志愿者中，有一部分人的血浆脯氨酸水平很高，抑郁程度也相对严重。结果他们的肠道菌群进入小鼠肠道后，小鼠的行为也跟着有了变化。研究人员发现，来自抑郁评分***高的受试者的肠道菌群，诱导小鼠出现了更明显的抑郁情绪特征。

不仅如此，研究人员还通过RNA测序发现，粪便移植后的小鼠，大脑中一些基因表达发生了变化。这些小鼠的前额叶皮层（这个脑区与认知有关）中，与抑郁行为相关的基因表达增加，以及一个关键基因——编码脯氨酸转运蛋白的基因slc6a20a表达增加。而这个脯氨酸转运蛋白的表达量高低，在果蝇实验中得到证明，会影响动物是否更容易出现抑郁行为。

尽管无法在人类身上进行类似的实验，但综合这些动物实验的结果来看，特殊的肠道菌群通过脯氨酸代谢影响了大脑在发展抑郁症状方面的功能。

研究人员指出，后续他们将进一步在人群中验证脯氨酸含量不同的饮食对抑郁症状与表现的影响，研究结果有望通过针对肠道菌群和膳食脯氨酸为有效抑郁症打开新的窗口。

生物磁珠对细胞筛选的方法已日渐成熟，原理是将包被一抗的磁珠与细胞表面对应的分子特异性结合，或者将包被二抗的磁珠与已经与细胞表面分子特异性结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附与分离柱或试管上，实现阳性细胞或阴性细胞的分离。洛阳吉恩特生物自主研发生产了各类生物磁珠，可以实现稳定的实验结果。

       在众多抑郁症的实验研究模型中，慢性社交挫败应激（Chronic social defeat stress，简称CSDS）模型因有明显的诱因、较好的建模成功率以及明显的表型呈现而被广泛认可。以常用的啮齿类动物模型为例，其原理是将一只受试动物与另一只具有攻击性的动物放一起，具攻击性的动物会反复、强势攻击受试动物，使其感受社交挫败应激，从而引发一系列类似抑郁的行为，如社交回避行为、蔗糖偏好降低、奖励阈值增加、悬尾试验和强迫游泳试验中不动性状态增加、认知障碍和快速动眼睡眠期异常等。

      本文将介绍一个常规的CSDS建模方案：将C57BL/6J小鼠与一只更大、更有攻击性的CD-1小鼠放在一起，从而诱导出C57BL/6J小鼠的抑郁样综合征（以其在社交方面的持久障碍如社交回避为特征）。该方案整个实验进程需要3 - 4周完成，包含三个重要阶段：

1. 攻击性CD-1小鼠的筛选阶段；

2. C57BL/6J小鼠社交挫败（Social defeat）阶段；

3. C57BL/6J小鼠社交（Social interaction，简称SI）检测阶段。

01

实验材料

1.矩形大鼠饲养笼（长48.3 cm × 宽26.7 cm × 高15.2 cm）；

2.多孔的隔离挡板（长45.7 cm × 宽0.6 cm × 高15.2 cm）；

3.视频追踪设备和软件（可用Panlab的Smart V3.0软件）；

（▲扫描二维码免费试 用）

4.非透明的旷场（侧壁包含可拆卸的有机玻璃罩，用于社交测试）；

02

实验动物

CD-1小鼠（30-50只）、C57BL/6J小鼠（50-80只）

03

实验设计

筛选阶段（实验时间为3天）

1. 购买4-6个月龄的非繁育CD-1雄性小鼠，实验前将CD-1小鼠单笼饲养7天以适应环境。（单笼饲养是为了培养并保持CD-1小鼠的攻击性，也可通过将CD-1小鼠与2只雌鼠放置3-4天后再拿出以培养其攻击性）

2. 购买一大批C57BL/6J小鼠（年龄6-7周最佳），从其中选取一批鼠（可被反复用于后续的筛选），专门用于筛选CD-1攻击鼠。

3. 对于单只CD-1小鼠的筛选而言，整个筛选过程持续3天，每天1次，每天将1只C57BL/6J小鼠放入CD-1小鼠的饲养笼中，持续3分钟后再拿出；每天换不同的C57BL/6J小鼠试验共进行3天。筛选标准：在三天的3分钟筛选过程中，CD-1小鼠必须在至少连续两天对C57BL/6J小鼠有攻击行为；且初次攻击的潜伏期在1分钟内。

社交挫败（Social defeat）阶段（实验时间为10天）

1. 提前一天将社交挫败实验笼（含垫料）准备好，并提前一晚将筛选出的CD-1小鼠放置于隔离挡板的一侧笼子中；（共需10只不同的筛选好的CD-1小鼠，每天准备1只）

2. 实验组：对于单只受试C57BL/6J小鼠而言，需接受连续10天的社交挫败应激实验，每天持续5-10分钟。每一天，将受试的C57BL/6J小鼠直接放置于准备好的含CD-1小鼠的那一侧实验笼中经历5-10分钟的社交对抗，此过程称之为直接接触应激。之后，将C57BL/6J小鼠放置到实验笼的隔离挡板的另一侧，放置24小时作为间接心理应激。此过程每只受试的C57BL/6J小鼠将每天面临1只不同的CD-1小鼠，连续重复上述操作10天。（对于单只CD-1小鼠而言，每天可面临多只C57BL/6J小鼠，取决于每组受试动物的只数）注意事项：实验过程应密切观察，以确保高质量的攻击行为正常发生。高质量的攻击行为需满足在实验的5-10分钟内，攻击行为持续且周期性发生；每分钟不少于1回合的攻击，每回合持续时间约5-10秒。若出现两只动物互相理毛的现象，视为该阶段实验失败。

3. 对照组：选取2只同年龄段C57BL/6J小鼠，参照实验组的实验（可以理解为将实验组中的CD-1小鼠替换为对照C57BL/6J小鼠），每天更换不同的实验笼，连续重复此操作10天。注意事项：实验过程应密切观察，避免两只小鼠发生肢体冲突。10天的社交挫败实验结束后，将所有的受试C57BL/6J小鼠单独饲养，24小时后（或根据实验设计时间）进行后续的社交检测阶段。

社交（Social interaction，简称SI）检测阶段（实验时间为1天）

1. 准备社交检测需要的旷场，摄像系统以及视频分析软件；

2. 视频记录：分别将受试C57BL/6J小鼠（对照组和实验组）依次单只放入社交旷场中，检测之前先让其适应环境1小时；之后继续实验进入视频记录阶段，开启摄像系统记录C57BL/6J小鼠在旷场中的轨迹追踪：先做2.5分钟的无CD1-1小鼠的轨迹追踪；中间间隔30秒，同时在旷场侧壁的有机玻璃罩内放入一只全新的攻击性CD1-1小鼠（此只小鼠在社交挫败阶段没被用过）；再做2.5分钟有CD1-1小鼠后的轨迹追踪。软件记录并分析该实验检测的指标，主要如下：a. 动物整体的轨迹以及总行程；b. 动物进入不同区域（主要是社交区域，角落区域根据需要进行记录）的次数以及停留时间。

3. 数据分析：通过软件记录相关指标之后，有两种数据分析方法：

根据软件的记录分析结果，直接比较放了CD1-1小鼠以及未放CD1-1小鼠的两个2.5分钟中，C57BL/6J小鼠分别在社交区域花的时间，分别定义为T1和T2；

计算放置和未放置CD1-1小鼠的两种情况下，C57BL/6J小鼠分别在社交区域花的时间比值，即T1/T2，被定义为SI比值，以SI比值等于1为分析标准。

理想状态下，由于动物的探索天性，在对照组的数据中，T1会大于T2，或者SI比值会大于1；而在实验组中，由于小鼠经受前期的社交挫败阶段，会对同类型的CD1-1小鼠产生社交回避，即出现T1小于T2或者SI比值小于1的数据。

然而在实际实验中，实验组的数据可能会指示受试C57BL/6J小鼠的两种亚型：一组鼠的数据和对照鼠更接近，我们称之为不易感小鼠，而另一组鼠表现和对照组有明显差异，被称之为易感小鼠。这两种亚型的划分对于一些疾病模型（如创伤后应激障碍）的研究有重要意义。

04

注意事项

1. 要确保每次实验时CD-1小鼠的攻击性。理论上通过筛选标准的CD-1小鼠可以使用3个月，进行3次CSDS模型的建立，但是在每一次新的模型建立前都需要再重新筛选一次。

2. 保持C57BL/6J小鼠保持7-8周龄时做社交挫败实验最佳，年龄过大（大于20周）的小鼠会降低社交挫败的效果。

3. 社交挫败实验可能使得受试动物形成外伤。对于本实验而言，外伤并不是必要的，而且长期的暴露性外伤会影响受试动物的后续评估。可采取的措施有：缩短社交挫败阶段的持续时间，或者适当地移除攻击性的CD-1小鼠。

4. 在单批次的10天社交挫败阶段造模结束后，应对整套实验笼具进行灭菌消毒并擦干，防止气味残留对下一批实验数据造成干扰。

【文献引用】

1.Golden, S. A., Covington, H. E., 3rd, Berton, O. & Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc 6, 1183-1191, doi:10.1038/nprot.2011.361 (2011).

2.Kim, H.-D., Call, T., Carotenuto, S., Johnson, R. & Ferguson, D. Testing Depression in Mice: a Chronic Social Defeat Stress Model. Bio-Protocol 7, doi:10.21769/BioProtoc.2203 (2017).

3.Krishnan, V. et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell 131, 391-404, doi:10.1016/j.cell.2007.09.018 (2007).

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