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样品制备是包括卡尔费休水分测定试验在内的大多数试验的开端，取样是样品制备的重要一环，对结果的正确性和准确性起着至关重要的作用。

Tips

在准备测定“陌生”的样品时，应注意：

·选取的样品的含水量必须与原始样品的平均含水量相同，即选取的样品必须具有代表性。

·无论你在哪个地区，不仅是在热带地区，都要注意大气湿度。

·易吸湿样品的表面附着有大量水分。

·易释放水分或者被风化的样品表面水分较少。

·如果水不是以溶解的形式存在，而是以分散的形式存在(沉淀或浮选，附着于容器壁--例如：石化产品，人造黄油)的液体样品会释放水分。

·在冷却过程中水的溶解度极限被削弱的样品。

·水在样品中的分布越不均匀，所需取的样品量越大。

·取样要尽量快，保证样品的含水量在运输和保存中没有发生变化。

大多数样品在取样称重后可以直接进行卡尔费休水分测定，但是对于一些难溶的或者与卡氏试剂有副反应的样品，就需要更多的制备步骤。

A. 稀释法     

可以进行外部萃取，也可以在水分测定中在滴定容器中萃取。萃取通常需要加热，很少在室温下进行。如果进行外部萃取，请注意所有的水分都不能被萃取出来，并保证样品和溶剂的平均含水量是可以得到的。这种方法主要用于谷类面粉。

B. 溶剂萃取法

选取的样品的含水量必须与原始样品的平均含水量相同，即选取的样品必须具有代表性。

无论你在哪个地区，不仅是在热带地区，都要注意大气湿度。

易吸湿样品的表面附着有大量水分。

C. 均质化       

有些样品的水分可以附着在样品壁上或者沉在瓶底，可以将瓶子放入超声波清洗器中进行超声。

对于糊状或者粘性样品，可以加入已知其含水量的助溶剂（如异丙醇）使分离出来的水分再次溶解。

固体样品根据材质的不同需要使用不同的手段进行粉碎和均质处理。

D. 加热法       

样品以干气流(空气或氮气)加热，或以干气流通过加热的样品，释放的水被转移到滴定容器中并立即被滴定。加热温度应该尽可能的高，但不能使样品分解或干扰二次组分的提取。加热法适用于不能被萃取或不能完全被萃取，以及会与卡氏试剂发生副反应的样品的测定。

初次使用扫描电镜（SEM）时，

您可能会疑惑到底能获取什么样的图像，您也可能会纠结怎样保证图像质量。其实，如果掌握了正确的样品制备技巧，您就可以轻松改善图像质量了。

首先，扫描电镜工作需要真空条件，而真空条件会对样品造成很大影响。例如，样品表面的松散颗粒会脱落，液体会即刻蒸发，易碎的材料会脱气。

图1. 苍蝇复眼的扫描电镜图像

您会发现对苍蝇很容易成像，但是要对苍蝇的幼虫成像，很可能会导致电镜中污渍飞溅。幼虫可以看作小的液体囊，如果内部水分蒸发，内部压力就会导致其皮肤崩塌甚至会发生爆炸。那么，气体和颗粒就会进入电子镜筒，并损害图像质量。

使用扫描电镜对水分含量高的样品成像，以下几点至关重要：

--在低真空下成像；

--冻结样品；

--烘干样品。

图2.-25°C 下苹果的扫描电镜图像

除了真空度，您还需要考虑样品表面电荷累积的影响，这会导致样品表面出现明亮的区域，从而掩盖所有细节，这种情况常常出现在聚合物和不导电材料中。

我们再强调一下，样品制备对于获得优质的图像十分关键。

使用扫描电镜对不导电样品成像时，我们应该：

--使用金属胶带使样品接地，并在胶带附近区域成像；

--使用金或其他导电镀膜材料在样品表面溅射镀膜；

--在低真空条件下成像。

图3.不导电羊毛样品的扫描电镜图像

要获得优质的扫描电镜图像，样品制备至关重要。花些时间学习不同类型样品的制备技巧，您就可以确保始终获得Z佳的图像结果。

如您希望了解更多有关使用扫描电子显微镜样品制备的信息，请填写表格与专家交谈。

表格地址：https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/global/forms/questionnaire-2017-form-cn.html?cid=cn-ebz-soc-wec-camp-wechat2018-aMSD-pc-mkt-05282018

应用对象

◆ 1 ◆      沛欧V100/V200全自动卡尔费休水分仪广泛适用于石油、化工、电力、制药、商检、科研、环保等领域。

拥有砖利

◆ 2 ◆  用于水分仪定量管的活塞实用新型砖利，砖利号：2016209973561  砖利号：2015304937822

沛欧V100卡尔费休水分仪控制软件，登记号：2016SR256224水分仪外观砖利

检测物质种类

◆ 3 ◆  *汽油，水压油，绝缘油，变压器油，透平油，抗燃油。

          *乙烷、二甲基丁烷、辛烷、十二烷、二十碳烷、环十二烷、加急丁二烯、苯、甲苯、二甲苯、乙基甲苯、二甲聚苯乙烯、十四烯、石油醚、环已胺、甲基环已胺、环庚、烷、乙烯环已胺、三甲基苯乙烯、苯、亚甲基菲、异甲基异丙基苯等。

             *酚类苯酚、甲酚、氟苯酚、氯酚、二氯苯酚、硝基酚等。

             *醚类二乙 醚、二甘醇单甲醚、聚乙二醚、苯甲醚、碘苯甲醚、二庚醚；

             *全部醇类、全部卤代烃类、全部脂类等。

技术指标

◆ 4 ◆ 卡尔费休水份仪含量测定范围： 0.005-

        滴定模式：正滴定

        滴定方法：可设定多种方法

        滴定速度：可依不同厂牌滴定试药调整，多种速度可选择。

        液体电阻补偿功能：针对不同溶剂与样品，无须更改侦测电极的感度与终点侦测电位，可得到较准确的侦测结果。

        具有电极开路、短路实时检测功能；

        计算功能：水分含量、统计计算、空白值与标定值自动平均功能。

        记录分析：仪器本身至少可储存500组分析结果。

          自动完成样品天平称量读入（V200可选配）

上海沛欧专业、专心生产凯氏定氮仪、红外石英消化炉、卡尔费休水分仪、二氧化硫检测仪、土壤阳离子交换量检测仪     

欢迎来电：021-64086301

（来源：上海沛欧分析仪器有限公司）

       锂离子电池必须完全无水（水的含量小于20 mg/kg），因为水与导电盐(如六氟磷酸锂)反应生成氢氟酸。

       所有电池都由正极、负极、隔膜和电解液组成。对于锂离子电池，阳极和阴极材料(活性材料)被涂覆在金属箔上。为了覆盖金属箔，活性材料与粘结剂混合，并以浆料的形式应用于金属箔上。典型的负极材料是碳黑/石墨，而阳极材料是锂化合物。阳极、隔膜和阴极箔通常被缠绕或堆叠。因此，隔膜防止阳极和阴极之间的接触。阳极和阴极之间的导电性是由电解质建立的。一般选择无水的非质子溶剂和锂盐的混合物作为电解质。

       卡尔费休库仑法水分测定仪 可以可靠且准确的测定用于锂离子电池的几种材料的含水量。

       ·制造锂离子电池的原材料(如：电解质溶剂、碳黑/石墨)

       ·阳极涂层和阴极涂层的电极涂层制剂(浆料)

       ·已涂覆的阳极箔和阴极箔，以及隔膜箔和组合材料

       ·锂离子电池电解质

       瑞士万通公司在卡尔费休水分测定仪的制造及不同样品的卡尔费休水分测定方面有着丰富的经验。针对目前发展迅速的锂电行业，瑞士万通经过大量的实验和研究，推出了锂离子电池水分测定的解决方案。

电解质和溶剂

       大多数电解质溶剂是极性非质子溶剂。由于氢键的构造，用烘箱法提取此类溶剂中的水通常很慢。因此，只要它们不与滴定剂发生任何副作用，建议直接滴定这种溶剂。

       ◆ 正确的pH值范围和在无水甲醇系统内进行滴定是成功的关键。

       ◆ 电解质溶液是亲水的，应尽量减少样品暴露在空气中的时间。

       ◆ 库仑法试剂的水容量有限，应注意监测试剂容量，适时更换。

       ◆ 相对漂移值不应高过5 μg/min。

碳黑/石墨

       可以通过直接滴定测定碳黑/石墨中的水分含量，但是直接滴定样品会污染滴定池，带来需要经常清洗滴定池的烦恼。选择采用气体萃取的方式可以大大减少频繁清洗的烦恼。

       ◆ 进样针不能直接插入样品否则会造成进样针堵塞，应使用专用的进样配件。

       ◆ 试剂中所含甲醇会蒸发，应定期对甲醇损失进行补偿，以避免测定结果过高。

       ◆ 使用惰性气体作为载气将释放出的水分输送到滴定容器中，通常使用氮气。

       ◆ 如果需要高准确度，推荐使用带隔膜的发生电极。

       ◆ 可以使用梯度升温程序，测定温度特性未知的样品。

       ◆ 相对漂移值不应高过5 μg/min。

阳极浆料

       用直接滴定法测定由石墨和n-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)制成的阳极浆料的含水量是不可能的，因为这类样品会产生干扰；因此，需要用气体萃取法进行滴定。

       ◆ 在样品中加入二甲苯，以降低样品的亲水性和粘度，使水分得到更好的释放。

       ◆ 试剂中所含甲醇会蒸发，应定期对甲醇损失进行补偿，以避免测定结果过高。

       ◆ 样品需充分搅拌，均匀的待测样品是得到重现性好的结果的关键。

       ◆ 蒸发的二甲苯会从样品瓶中被载气带入滴定池中。

       ◆ 进样针不能直接插入样品否则会造成进样针堵塞，应使用专用的进样配件。

       ◆ 使用惰性气体作为载气将释放出的水分输送到滴定容器中，通常使用氮气。

       ◆ 库仑法试剂的水容量有限，应注意监测试剂容量，适时更换。

       ◆ 可以使用梯度升温程序，测定温度特性未知的样品。

       ◆ 相对漂移值不应高过5 μg/min。

已涂覆的阳极箔和阴极箔以及隔膜箔

       利用气体萃取技术可以很容易地测定已涂覆的阳极箔和阴极箔、隔膜箔和组合材料的水分含量。

       ◆ 试剂中所含甲醇会蒸发，应定期对甲醇损失进行补偿，以避免测定结果过高。

       ◆ 库仑法试剂的水容量有限，应注意监测试剂容量，适时更换。

       ◆ 使用惰性气体作为载气将释放出的水分输送到滴定容器中，通常使用氮气。

       ◆ 可以使用梯度升温程序，测定温度特性未知的样品。

       ◆ 相对漂移值不应高过5 μg/min。

Western Blot 是一种用于检测蛋白质以及蛋白质翻译后修饰的常用方法，可以对简单或复杂生物样品中的目标蛋白质进行半定量或定量分析。其操作步骤包括：

•从细胞、组织或体液中制备样品（蛋白质提取和蛋白质浓度测量）

•十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶通过电泳按大小分离蛋白质

•将分离的蛋白质固定在硝酸纤维素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上

•封闭膜上的非特异性蛋白

•用特异性一抗探测靶蛋白

•与标记的化学发光或荧光分子偶联的二抗共孵育

•检测反映抗原/抗体结合的信号

•使用软件对目标蛋白条带进行光密度分析

Western Blot是分子生物学和蛋白质组学中Z常用的技术之一。但Western Blot是一个多步骤的操作流程，因此任何一个步骤发生错误，都会导致的结果发生变异，从而降低了该技术的可靠性和可重复性。有研究表明，Western Blot的一些关键步骤，例如样品制备方法、跑胶、转膜、抗体的选择以及定量所用的归一化方法，对于可再现的蛋白质印迹结果至关重要。

--样品制备--

Western blot步骤中的一个经常被忽视的方面是有效的样品制备。有效的蛋白质提取和纯化步骤对蛋白质印迹实验的结果和解释有重要影响。为了有效地提取蛋白质，应该选择一种合适的均质化方法，该方法可以通过细胞膜的破裂有效地释放细胞内的内容物。另外，应该选择Z佳的裂解缓冲液以促进蛋白质的正确溶解并防止蛋白水解降解，从而获得大量的目标蛋白质。

样品制备的原则

•尽可能采取简单方法，避免蛋白丢失；

•尽可能将所有待分析的蛋白质样品全部溶解；

•细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶YZ剂防止蛋白降解；

•提取过程中避免蛋白产生聚集、沉淀和变性；

•防止发生人为的蛋白质样品化学修饰（例如加入尿素不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白）；

•尽可能去除样品中的非蛋白杂质和干扰蛋白；

•样品裂解液新鲜配置，并分装冻存于-80℃。勿反复冻融；

•制备方法应具有标准化、重现性、可靠性和简便性。

蛋白样品的类型

可溶性蛋白：

•培养细胞中可溶性蛋白，包括：细胞质中的可溶性蛋白、细胞周质蛋白、细胞器相关蛋白、分泌到培养基中的可溶性蛋白。

•自然宿主细胞中可溶性蛋白，包括：微生物、植物和动物细胞中的可溶性蛋白。

不溶性蛋白：

•含包涵体的不溶性蛋白

•膜相关蛋白和难溶性蛋白（非重组蛋白）

蛋白样品制备的流程

•组织、细胞或菌体的破碎和裂解

•沉淀溶液中蛋白

•清除杂质

•蛋白浓缩、纯化

组织或细胞破碎和裂解

为了全面分析细胞内的蛋白，需要对组织或者细胞进行有效地破碎和裂解，其方法取决于蛋白样品的来源。同时，因细胞破碎时蛋白酶可能释放出来，从而导致蛋白降解，影响后续实验结果，因此需要加入蛋白酶YZ剂进行保护。

破碎裂解的方法

温和破碎裂解法（针对组分单一或者分析某一特定组分）：

•渗透裂解（血细胞、组织培养细胞）：将细胞悬浮于渗透溶液中，细胞因肿胀而释放细胞内容物。

•冻融裂解（细菌细胞、组织培养细胞）：反复冻融裂解细胞，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度ZG引起肿胀，使细胞结构破碎。

•裂解液裂解（组织、培养细胞）：含有去污剂的裂解液处理组织或细胞，使细胞膜破碎，细胞内容物释放出来。

•酶裂解（植物、细菌、真菌细胞）：利用酶裂解含有细胞壁的细胞。

•剧烈破碎裂解法（难于破碎细胞：固体组织、坚硬细胞壁）：

•超声裂解（悬浮细胞）：利用超声波产生的切应力来裂解细胞，超声时应在冰上间歇进行。

•弗氏细胞压碎器裂解（含有细胞壁的细胞）：细胞悬液置于高压下QL挤出小孔，压力突然降低以及剪切力的作用导致细胞爆裂破碎。

•机械匀浆裂解（固体组织、细胞悬液）：将组织剪成小块，利用匀浆器在加蛋白酶YZ剂的匀浆液中破碎组织或者细胞。

•研磨法（固定组织、微生物）：样品冻存在液氮中，利用研钵和研杵快速将样品研磨成粉状。

玻璃珠匀浆裂解（含有细胞壁的细胞）：利用剧烈震荡的玻璃珠打碎细胞的细胞壁，从而释放细胞的内容物。

裂解液一般组成

•缓冲液（Tris-HCl）：提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。

•去污剂（表面活性剂）：破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。

•蛋白酶YZ剂：YZ蛋白酶的活性，防止蛋白被水解。

•磷酸酶YZ剂：YZ磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化。

•还原剂：二硫键断裂和蛋白质变性

•其它：NaCl，促进细胞膜破裂使蛋白溶解。

常见裂解液成份一览表

蛋白酶YZ剂的类型

常用的蛋白酶YZ剂：

丝氨酸蛋白酶YZ剂：PMSF，AEBSF-HCl，Aprotinin（抑肽酶）, Chymostatin，亮肽素（Leupeptin）。

天冬氨酸蛋白酶YZ剂：PMSF，碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物。

巯基蛋白酶YZ剂：PMSF，TLCK，TPCK，Antipain-HCl,N-乙基顺丁烯二酰亚胺。

金属蛋白酶YZ剂（金属离子螯合剂）：EDTA，EGTA，塔罗肽。

（磷酸酶YZ剂：NaF、激活的原矾酸钠、焦磷酸钠、β-甘油磷酸钠。）

^{常见的蛋白酶YZ剂一览表}

参考文献：

Protein Purification and analysis: next generation Western blotting techniques, Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.

An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25.