基因扩增仪

聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应，其英文Polymerase Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，通过高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应形成一个周期，目的DNA迅速扩增，其具有节约时间，操作简单，高灵敏度，强特异性等特点。其又被叫做无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。其不但在核酸序列分析和基因分离、克隆被使用，其还在任何有DNA,RNA的地方被使用或者被用来对疾病进行诊断。

普通PCR仪操作规程

开机操作

（1）将PCR仪电源开关打开。

（2）将PCR仪顶盖向后平推，然后将PCR薄壁管放进去。

（3）将PCR仪顶盖向前平推，并且均匀用力压下反扣部分。

值得注意的是：9700PCR仪必须使用圆头的PCR薄壁管。

关机操作

（1）实验结束后，点击EXit到主界面出现，将PCR电源开关关闭。

（2）均匀用力抬起反扣部分，将PCR仪顶盖向后平推，将PCR薄壁管取出。

（3）将PCR仪顶盖向前平推。

荧光定量PCR仪操作规程

1.开始运行仪器

将PCR仪底座开关打开，再将定量PCR仪检测器开关打开。在实验之前，首先对系统预热半个小时，打开电脑，将iQ5软件启动。

2.放置样品

在0.2ml的薄壁管或96孔板内加入PCR反应体系，将管盖盖上，注意，不要让手指和反应管表面有接触，所以必须将一次性塑料手套戴上。按照顺序在仪器的加热孔中放入反应管。

3.设置程序，运行试验

定量PCR软件的基本操作步骤如下：

（1）对热循环程序文件进行设置。

（2）对反应管文件进行设置。

（3）点击“run”键，将程序运行。

（4）数据分析

4.结果分析

（1）PCR反应结束后，标准曲线和Ct值软件会自动计算。

（2）可以在软件窗口选择相应的分析功能进行表达量分析，等位基因分析。

（3）点击右上方的“Report”键，还能够将结果报告单输出。

5.关闭运行仪器

实验结束后将iQ5软件、荧光定量检测器及扩增系统电源关闭，将电脑关闭，将反应管取出。

与基因扩增仪的工作原理相关文文章：
• real time pcr介绍
• PCR仪的热盖及其作用
• PCR方法

由于准确的实验结果，较快的运行速度以及简单的操作，使得荧光定量PCR越来越受到分子分子生物学研究者的青睐。市面上有很多种类很多PCR，让人眼花缭乱，使得选择变得异常困难。不仅要向实验室成员征询意见，对实验室目前甚至以后的需求进行而且要对实验室的预算进行平衡，更加要对各种极富诱惑力的宣传知识进行详细的研究。那么面对各种不同性能的产品，到底应该怎样选择呢？

首先为大家介绍荧光定量PCR的两个误区：

一、仪器通道越多越好

随着PCR技术的成熟运用，荧光定量PCR仪通道越来越多。4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪被各个厂家推出。其实有些荧光定量PCR的检测通道多，但有效通道却没有那么多，有效通道至关重要。还需要注意有的荧光定量PCR的检测通道是只为厂家的专用的荧光染料或试剂开放的。而且使用校正染料可能会使得后期的使用成本增加。因此对于多重荧光定量PCR的通道数的选择应该从实验室的实际情况出发。

二、real-timePCR仪无需梯度功能

其实，如果使用有梯度功能的荧光定量PCR，那么以往多次实验才能完成的优化过程现在能够一次完成，使得摸索?PCR反应条件的繁琐实验简化了，不仅使得效率得到提高，时间得到了节约，而且节约了成本。

那么选择的关注点又是什么：

1.仪器的检测通量

当对定量PCR仪进行购买时，不同通量的仪器按照实验室的需求来选择，96孔的通量足够进行一般的基因表达研究或病原体检测，若需要寻找要新药靶点和疾病标记，那么就选择384孔板的仪器。

2.硬件设计特点

荧光定量PCR仪主要有传统的96孔板式、创新的离心式等，每种设计既有优点又有缺憾。

3.运行速度

在荧光定量PCR仪的众多技术参数中，厂家喜欢大力宣传的指标就是升降温速度。更快的升降温，能够使得反应进行的时间缩短，而且使得可能的非特异性结合反应的时间缩短了，提高使PCR的特异性得到提高。能快速运行的荧光定量PCR仪能够更好的完成实验。

4.灵活性

定量PCR仪能够升级和更换模块，非常的灵活。

与基因扩增仪的分类相关文文章：
• PCR常见问题及常见故障
• 实时荧光PCR仪的分类性能以及应用
• PCR引物设计的目的和原则

聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应，其英文Polymerase Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，通过高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应形成一个周期，目的DNA迅速扩增，其具有节约时间，操作简单，高灵敏度，强特异性等特点。其又被叫做无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。其不但在核酸序列分析和基因分离、克隆被使用，其还在任何有DNA,RNA的地方被使用或者被用来对疾病进行诊断。

PCR的三种控温方法

1.计算控制

在运行多数程序中，Z好的温度控制方法就是计算控制，温度的一致性以及可靠性都比较的好。使用计算控制的时候，模块的温度通过对样品的管子或玻片热传导的速度和样品的体积进行估算（当程序运行的时候，会显示这些样品的信息）。由于这种估算遵循已知的容量和热力学的规律，因此和模块控制以及探针控制相比，计算控制更极ng准。运行计算控制能够使得实验时间缩短，简单的程序操作能够使得酶的活性得到保护，使得引物的损失减少。

2.模块控制

和计算控制相比，模块控制的精确度要更加低些。在模块控制下，样品温度达到设置温度的时间一般在模块之后。之所以会有这段延迟，是样品体积和管子类型的缘故。

3.探针控制

探针控制一般能够在不同的环境中使用，然而其需要被小心的使用。微信版和玻片就可以。

应用：

1.血液检验漏检率

由于实时荧光定量PCR方法比Elisa灵敏很多，因此，血站或血液研究所一般用来研究Elisa方法的漏检率，即分析Elisa方法测定为阴性的血样，再用实时荧光定量PCR方法来复检。复检时，一般24个Elisa阴性的血样混合成一个样本进行检测。

2.新诊断及检验试剂的开发

现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa法等等，而荧光定量PCR方法以则可以做到这一点，从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂，从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等；这类试剂的种类是非常多的，所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。

3.新药开发研究，人用药物及其他药物

针对一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、细菌病等，在新药的开发过程中，快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金，与以前所用的Elisa等方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量，因此有利用分析药物的作用效果，为比较不同的配方的LX、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。

与基因扩增仪的注意事项相关文文章：
• PCR反应所需要的时间的影响因素
• Real-Time PCR引物设计原则及其应用
• PCR反应五要素

Real-Time PCR 技术，又称实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，Z后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。

介绍

荧光定量PCR的光学系统

荧光检测系统

旋转机制：

（1）成本低廉，高温均一性好。

（2）不太容易操作，对于低温储存不支持。

（3）需要特殊的加样支架和耗材

扫描机制：

（1）检测时间之后，需要更多的检测时间。

（2）价格便宜，操作方便，校正容易。

CCD：

（1）能够同时检测。

（2）价格不便宜，校正很困难。

激光光源

Lamp

（1）对于多通道以及多种不同的光路颜色都适用

（2）对2D传感器方案唯yi适用

（3）对高能量分析系统适用

LED

（1）一般用于孔扫描模式

（2）有比较多相对可选的光路颜色

（3）价格和维护的成本比较低

Laser:

（1）只能够在逐孔扫描模式下使用

（2）光路的颜色有限

（3）价格和维护的成本比较高

（4）能量高，信号不容易受到干扰。

热模块系统

空气离心加热模块

1.不方便加样

2.偏低的通量（32或者72）

3.比较差的温控准确性

4.很好的温度均一性

5.比较快的升降温度（高于每秒5摄氏度）

半导体加热模块

1.比较差的温控均一性

2.比较慢的的升降温度

3.很好的温控准确性

4.比较方便加样

5.有很高的通量

荧光定量PCR仪的选择标准

1.灵活性

2.运行速度

3.硬件设计特点

4.耗材的开放性

5.仪器的通道数量

6.仪器的检测通量（反应孔数）

7.仪器使用的广泛程度

与基因扩增仪的故障分析相关文文章：
• PCR仪的发展、使用和保养
• 荧光定量PCR技术
• PCR扩增依据

在基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达、临床诊断、流行病学、遗传学、生物技术、环境科学、微生物学、食品工业、司法科学、分子生物学、医学等领域，以检测DNA/RNA为目的，以聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction , PCR）为特征对各种病原体进行检测和基因分析，PCR基因扩增仪均合适使用。

尽管PCR仪器不是计量仪器，然而其的作用原理和基本计量要素有很密切的关系，因此，PCR仪需要定期检测和维护。

仪器的维护保养：

1．样品池的清洗

首先将盖子打开，然后在样品池加入95%乙醇或10%清洗液，浸泡5min，然后对被污染的孔进行清洗，使用微量移液器对液体进行吸取，使用棉签将剩余液体吸干。打开PCR仪，设定保持温度为50℃使PCR程序运行，挥发去除残余液体，通常只需要5-10分钟左右。

2.热盖的清洗

对于荧光定量PCR仪，若出现荧光污染，并且样品池不是这一污染的来源，或者当热盖的松紧受到污染或残迹物的影响时，垫盖底面需要用压缩空气或纯水清洗，使样品池的孔干净，无污物阻挡光路得到保证。

3.仪器外表面的清洗

对仪器的外表面进行清洗能够使灰尘和油脂除去，然而不能达到消毒的效果，对PCR仪的外表面进行清洗Z好选择没有腐蚀性的清洗剂。

4．更换保险丝

首先关掉PCR仪，将插头拔取，将电源插口旁边的保险盒打开，将备用的保险丝换上，观察是否恢复正常。

仪器的维护和保养的注意事项：

1)PCR仪器需要视制冷方式而定通常进行半年至少一次定期检测。

2)PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度不相同，如果通过检测，与设置温度相比较，各孔平均温度差超过1～2℃，那么可以对PCR实际反应温度差运用温度修正法来纠正。

3)升、降温过程的时间控制是PCR反应过程的关键时间越短越好，如果PCR仪的降温过程高于1分钟，那么就应该对仪器的制冷系统进行检查。当PCR仪是使用风冷制冷时，其反应底座的灰尘要较彻底地清理，若是其他的制冷系统，那么应该对相关的制冷部件进行检查。

4)通常情况下，如果仪器的温度能够采用温度修正法纠正，那么不要轻易地对仪器的电子控制部件打开或调整。

与基因扩增仪的选购指南相关文文章：
• PCR实验实验室布局
• 实时荧光定量PCR
• PCR的反应流程

　　荧光定量基因扩增仪的PCR扩增原理和普通基因扩增仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。该仪器主要用于医学临床检测，生物医药研发，食品行业，科研院校等机构。

荧光定量基因扩增仪的原理

　　标记有荧光素的TaqMan探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的TaqMan探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得CT值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

荧光定量基因扩增仪与普通基因扩增仪的区别

　　荧光定量基因扩增仪比普通基因扩增仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。

　　荧光定量基因扩增仪主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，而普通基因扩增仪是做定性分析和扩增基因片段，荧光定量基因扩增仪可以做普通基因扩增仪的工作，而反之就不行了，况且这样代价太大了，一般的实验室都不允许这样做的。总之两者的功能不能互相取代。

　　普通基因扩增仪只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多，而且运行成本也要低很多。不过不能直接得到扩增结果，还需要做电泳检测。实际中检测遗传疾病，品种分子标记筛选，甚至亲自鉴定等都可以由普通基因扩增仪完成。

　　但是，某些需要定量的实验就必须用到实时定量基因扩增仪了。比如检测某些病原物的数量(血液乙肝病毒复制程度)，特定基因的表达量(比如结合反转录做的RNA定量分析)，某些基因在染色体组中拷贝数等等。荧光定量基因扩增仪一般不需要对扩增产物进行电泳分析，操作相对简单些，但是耗材实在是贵。

　　简单来说，普通基因扩增仪只能扩增，不能检测，便宜。荧光定量基因扩增仪除了扩增，还能在扩增的同时检测DNA发出的荧光信号，试剂和仪器都更贵。

荧光化学物质

　　荧光定量基因扩增仪所使用的荧光物质可分为：荧光探针和荧光染料。其原理简述如下：

　　1、荧光探针：

　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。

　　PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

　　荧光探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变，有望成为基因诊断和个体化用药分析的shou选技术平台。

　　2、荧光染料：

　　在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光染料仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

　　3、分子信标：

　　是一种在5'和3'末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光 。

荧光定量基因扩增仪的应用

　　荧光定量基因扩增仪适用于临床及科研以聚合酶链式反应为特征的、以实时荧光定量检测分析DNA/RNA为目的的病原体检测及基因分析。

　　临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和LX评价;地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断。

　　动物疾病检测：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

　　食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

　　科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

　　应用行业：各级各类YL机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

　　由于荧光定量基因扩增仪是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

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