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动物性食品中杆菌肽残留量测定的前处理方法

杆菌肽的危害及检测目的

杆菌肽是由一组类似的多肽成分组成的混合物，其中杆菌肽A、B1和B2组分被认为ZJ抗微生物活性。兽医临床上常见以杆菌肽锌和杆菌肽亚甲基水杨酸盐形式用于畜禽促生长和FZ动物的坏死性肠炎。在欧盟，亚甲基水杨酸杆菌肽还被推荐用于ZL由产气荚膜梭菌引起的兔坏死性肠炎。杆菌肽KJ谱广、吸收低，但会带来神经毒性和肾毒性，还会产生抗药性风险，是ZL中使用普通抗生素无效的ZH选择。若该类抗生素通过食物链进入人体，会对人体造成健康隐患。因此我国农业农村部和国家市场监督管理总局2019年发布的GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药ZD残留限量》中明确规定了杆菌肽在动物靶组织中的残留限量。

本文阐述了如何将杆菌肽从样品基质中分离提取出来，并经过净化后，转化成液质联用仪可以检测的形式。以提取、净化为ZD，依据国标GB/T 20743-2006，为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。

检测项目：杆菌肽

应用范围：猪肉、猪肝和猪肾

液相色谱-质谱/质谱法

方法原理：试样中杆菌肽残留用酸化的甲醇水匀浆提取，经双硫腙三lv甲烷溶液进行液液分配净化后，再经固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。

前处理仪器：

分析天平（感量0.01 g 和0.1 mg）；高速组织捣碎机（10000 r/min）；振荡器；离心机（4000 r/min）；离心管（10 mL和60 mL具塞）；贮液器（50 mL）；固相萃取真空装置；氮吹仪；微量注射器（25 μL和100 μL）。

检测仪器：LC-MS/MS+ESI源

样品的制备与保存

猪肝脏、肾脏要去除脂肪和其他的非肝脏、肾脏组织，猪肉要去皮和骨头，将其搅碎拌匀，分出0.5 kg作为试样，将制备好的试样密封，并做上标记。试样置于零下18 ℃条件下保存。

前处理方法

1.提取

称取10 g试样（精确到0.01 g ）置于60 mL离心管中，加入0.1 mL甲酸和20 mL甲醇+水（1+1），于高速组织捣碎机上匀浆提取1 min，然后加入20 mL经甲醇+水（1+1）饱和的0.0025 %双硫腙三lv甲烷溶液，于振荡器上剧烈振荡10 min，以4000 r/min离心10 min，取上清液10 mL于50 mL试管中，弃去其余上清液。

往上述双硫腙三lv甲烷溶液中加入30 mL水，捣碎残渣，置于振荡器上剧烈振荡10 min，移取全部上清液于另一60 mL离心管中。重复提取一次，合并上清液，混匀，以4000 r/min离心10 min，取上清液30 mL与50 mL试管中的提取液合并，混匀。

2.净化

在预处理过的固相萃取柱（HLB 60 mg/3 mL用3 mL甲醇和3 mL水活化）顶部连接贮液器，移入上述试管中样液，待样液全部通过萃取柱后，加入2 mL水，弃去全部流出液。然后，将固相萃取柱在50 kPa～55 kPa的负压下抽干1 h，ZH用2 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL试管中，洗脱液在35 ℃水浴中用氮气吹干，用0.5 mL甲醇重新溶解残渣，再加入0.5 mL 0.3 %甲酸溶液，摇匀后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

国标解读及注意事项

1.杆菌肽标准物质用0.1 %甲酸甲醇溶液配成浓度为0.1 mg/mL的标准储备液，在2 ℃～4 ℃保存，有效期3个月。

2.本方法使用酸化甲醇水均质提取，经双硫腙三lv甲烷液液分配净化后，再用HLB固相萃取柱净化，相当于5 g样品进行上机检测。

3.杆菌肽易溶于水，在弱酸性条件下稳定，有机相越高回收率越低，使用酸化甲醇水（1+1）提取回收率高但是容易乳化，使用双硫腙三lv甲烷进行液液分配净化，离心后可降低乳化程度，使上清液更加清澈。

4.通过两次水洗双硫腙三lv甲烷残渣，不仅可提高目标物的回收率，确保稀释倍数准确，还可以在合并上清液后降低甲醇比例，为下一步固相萃取净化做好准备。

5.固相萃取过程中需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下，以保证净化富集的效果。

6.本方法使用基质标准工作溶液进行定量分析，根据具体检测样品选取合适的基质制作空白样品提取液配制基质曲线。

参考文献

GB/T 20743-2006 猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

图1 猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量测定的前处理流程图

文章来源：标准物质ZX（https://www.gbw-china.com/)