GB 31658.20-2022 动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
酰胺醇类药物属于广谱抑 菌剂,可以通过抑 制蛋白质的合成,从而达到抑 菌的效果。此类药物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考,而氟苯尼考胺是氟苯尼考的一种代谢产物。其中氯霉素残留时间较长,具有很大的毒副作用,可导致动物产生严重的再生障碍性贫血这一不良反应,易造成安全风险。因此氯霉素已经被世界卫生组织及许多国家禁止使用在食品动物方面,中国农业部也已将其列为禁药。而甲砜霉素和氟苯尼考(为甲砜霉素的氟化衍生物)由于不含硝基,不会引起再生障碍性贫血,因此被允许用于食品动物中细菌性疾病的防控治 疗。根据GB 31650-2019 《食品安全国家标准 食品中兽药最 大残留限量》要求,甲砜霉素和氟苯尼考每日容许摄入量(ADI)分别为0 μg/kg bw-5 μg/kg bw和0 μg/kg bw-3 μg/kg bw。
针对于GB 31658.20-2022《动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》,对方法进行优化,采用内标法定量,对不同基质中的酰胺醇类药物及其代谢物残留量进行了检测,验证方法标准曲线线性良好,回收率高,精密度好。
01
标准溶液配制
1.1
标准品
表1-1 标准品基本信息
1.2
标准溶液配置:
混合标准中间液(-18℃,3个月):分别精密量取氯霉素标准储备液0.05 mL,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准储备液各0.25 mL,于5 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成氯霉素浓度为1 μg/mL,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度为5 μg/mL混合标准中间液。
混合标准工作液1(现用现配):取混合标准中间液0.1 mL,用20%甲醇溶液稀释成1 mL,氯霉素浓度为100 μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度为500 μg/L。
混合标准工作液2(现用现配):取混合标准工作液1 0.1 mL,用20%甲醇溶液稀释成1 mL,氯霉素浓度为10 μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度为50 μg/L。
混合内标中间液(-18℃,3个月):分别精密量取氯霉素-D5标准储备液0.05 mL,甲甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3标准储备液各0.25 mL于5 mL容量瓶中,甲醇稀释至刻度,配制成氯霉素-D5浓度为1 μg/mL,甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3浓度为5 μg/mL混合内标中间液。
混合内标工作液(现用现配):取混合内标中间液0.05 mL,用20%甲醇溶液稀释成5 mL,氯霉素-D5浓度为10 ng/mL,甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3浓度为50 ng/mL混合内标工作液。
1.3
标准曲线:
用20%甲醇水溶液稀释,配制成氯霉素浓度分别为0.2 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度分别为1 μg/L、2.5 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L,氯霉素-D5浓度均为1 μg/L,甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考胺-D3浓度均为5 μg/L的系列标准溶液,临用现配,供液相色谱串联质谱仪测定。以定量离子峰面积比为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线,求回归方程和相关系数。
表1-2 标准曲线配置信息
02
前处理操作
2.1
样品前处理
取试料2g(准确至±0.05g),置于50mL 离心管中,加混合内标工作液100μL,涡旋混匀,再加2%氨化乙酸乙酯(氨水:乙酸乙酯=1:50,v/v)溶液10mL(牛奶样品需另加无水硫酸钠3g),涡旋30s,涡旋振荡10min,8000r/min离心5 min。上清液转入另一50mL离心管中,残渣中加2%氨化乙酸乙酯溶液10mL,重复提取一次。合并两次提取液,于50℃氮气吹干,待净化。
取待净化残渣,加4%氯化钠水溶液(w/v)3mL,涡旋使溶解,再加4%氯化钠饱和的正己烷5mL,涡旋30s,8000r/min离心5min,弃去上层正己烷层,用4%氯化钠饱和的正己烷重复脱脂一次。加2%氨化乙酸乙酯溶液5mL,涡旋振荡5min,8000r/min离心5min,取上层有机相。用2%氨化乙酸乙酯溶液5mL重复萃取一次,合并有机相,50 ℃氮气吹干,加20%甲醇水溶液1mL,涡旋30s。过0.22μm尼龙滤膜(货号:SCAA-104),供液相色谱-串联质谱仪测定。
03
仪器条件
3.1
液相色谱:
a) Athena C18 液相色谱柱(2.1 mm*100 mm,1.8 μm,货号:LAEQ-2110UA);
b)柱温:30℃;
c)流速:0.30 mL/min;
d)进样量:5 μL;
f)流动相:A 为10 mmol/L甲酸铵水溶液;B为乙腈;梯度洗脱程序见表3-1。
表3-1 梯度洗脱程序
3.2
质谱条件:
a)离子化模式:电喷雾离子源(ESI),正/负离子模式;
b)扫描模式:多反应离子监测(MRM);
c)离子源温度:正/负离子模式均为500℃;
d)喷雾电压:正离子模式时4500V,负离子模式时-4500V;
e)目标化合物监测母离子、子离子、离子化模式和碰撞能见表3-2:
表3-2 目标化合物质谱监测信息
注:*为定量离子
注意事项:
国标中甲砜霉素-D3的定量离子对为357.2>293.0,氟苯尼考-D3的定量离子对为359.2>339.0,因自然界中氯同位素分布的影响,导致外标甲砜霉素和氟苯尼考的碎片离子中也包含这两个离子对,会导致内标峰面积的增加,因此甲砜霉素-D3和氟苯尼考-D3使用标准中的定量离子对会导致标准曲线的线性较差,影响定量准确性。为解决这个问题,提供以下2种解决方案
① 对甲砜霉素-D3和氟苯尼考-D3的子离子进行筛选,得到了甲砜霉素-D3(357.1>273.0)、氟苯尼考-D3(359.1>188.1)这两个定量离子对,内标峰面积变化相对平稳,在标准要求的线性范围内标准曲线相关系数可达到0.995以上。
② 提高内标浓度(均扩大10倍),这样可缩小外标对内标峰面积的影响,STD1-STD6线性曲线良好,相关系数R2>0.995。
04
实验谱图
图4-1 混合标准溶液(氯霉素5 μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L)谱图
图4-2 牛奶基质空白样品实验谱图
图4-3 牛奶基质加标(氯霉素5 μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L)样品实验谱图
图4-4 鸡蛋基质空白样品实验谱图
图4-5 鸡蛋基质加标(氯霉素5 μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L)样品实验谱图
图4-6 猪肉基质空白样品实验谱图
图4-7 猪肉基质加标(氯霉素5 μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L)样品实验谱图
注:猪肝样品基质中有氟苯尼考检出(0.18 μg/kg),低于标准中的方法检出限(<0.5 μg/kg)。
图4-8 猪肝基质空白样品实验谱图
图4-9 猪肝基质加标(氯霉素5 μg/L,甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺25 μg/L)样品实验谱图
05
实验数据
5.1
标准曲线:
表5-1 酰胺醇类药物标准曲线
5.2
加标回收率数据:
表5-2 四种基质样品加标实验回收率(n=4)
06
实验结论
参考《GB 31658.20-2022 动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》标准,部分内标选用优化后特征离子对替代原标准推荐离子对(甲砜霉素-D3:357.1/273.0,氟苯尼考-D3:359.1/188.1),采用优化后的方法进行检测。四种目标物的线性范围内标准曲线线性方程 R2>0.995,线性良好。四种基质的2个水平的加标回收率均在85%-110%之间,回收率良好,RSD<10%,可满足实验要求。
标签:酰胺醇类药物
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