人抗胰岛素受体抗体试剂盒说明书

人抗胰岛素受体抗体（AIRA）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒
实验目的：本试剂盒仅供研究使用，用于测定人血清，血浆及相关液体样本中抗胰岛素受体抗体（AIRA）水平。
实验原理：
本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人抗胰岛素受体抗体（AIRA）。用纯化的人抗胰岛素受体抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中抗胰岛素受体抗体（AIRA）相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的抗胰岛素受体抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人抗胰岛素受体抗体（AIRA）存在与否。
样本处理及要求：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3YZ辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：
编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）
加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，
温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
温育：操作同3。
洗涤：操作同5。
显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟
终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

结果判定：
试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00;阴性对照平均值≤0.10
临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15
阴性判定：样品OD值<临界值（CUTOFF）者为抗胰岛素受体抗体（AIRA）阴性
阳性判定：样品OD值≥临界值（CUTOFF）者为抗胰岛素受体抗体（AIRA）阳性
注意事项
1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。
2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物请避光保存。
6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm
7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。
试剂盒保存：2-8℃。
有效期：6个月
HumanAnti-InsulinReceptorantibody
FORRESEARCHUSEONLY

DrugNames
GenericName：HumanAnti-InsulinReceptorantibody(AIRA)ELISAKit.
Purpose
ThiskitallowsforthedeterminationofAIRAconcentrationsinHumanserum,andotherbiologicalfluids.
Principleoftheassay
ThekitassayAIRAlevelinthesample，usePurifiedAIRAantigentocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantigen,thenaddAIRAtowells,CombinedWithAIRA,afterwashingandremovingnon-combinativeantibodyandothercomponents,thenCombinedAIRAantigenwhichwithHRPlabeledbecomeantigen-antibody-enzyme-antigencomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.ComparedwiththeCUTOFFvalue,accordingtothistojudgeAIRAexistinthesampleornot.
Specimenrequirements
serum-coagulationatroomtemperature10-20mins，centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.
plasma-usesuitedEDTAorcitrateplasmaasananticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.
Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospinalfluidReferencetoit.
cellculturesupernatant-detectsecretorycomponents,collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,detectthecompositionofcells,DilutcellsuspensionwithPBS（PH7.2-7.4）,Cellconcentrationreached1million/ml,repeatedfreeze-thawcycles,damagecellsandreleaseofintracellularcomponents,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.
Tissuesamples-Aftercuttingsamples,checktheweight,addPBS（PH7.2-7.4）,Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesat2-8℃aftermelting,addPBS（PH7.4）,HomogenizedbyhandorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant.
extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,and首ldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Can’tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.
Assayprocedure
1.Number:tosamplecorrespondmicrotitrationwellandNumberSequence,eachplate首ldbesetfemininecomparison2wells,masculinecomparison2wells,blankcomparison1well(don’taddsampleandHRP-Conjugatereagenttoblankcomparisonwell,othereachsteptheoperationaresame).
2.addsample：separatelyaddPositivecontrolandNegativecontrol50μltothePositiveandNegativewell.addSampledilution40μltotestingsamplewell,thenaddtestingsample10μl.addsampletothebottomofELISAplatescoatedwell,don’ttouchthewellwallasfaraspossible,andGentlymix.
3.Incubate:AfterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30minat37℃.
4.Configurateliquid:30-fold(or20-fold)washsolutiondiluteduntil600ml,andreserve.
5.washing：UncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat.
6.addenzyme：AddHRP-Conjugatereagent50μltoeachwell,excepttheblankwell.
7.incubate：Operationwith3.
8.washing：Operationwith5.
9.color：AddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat37℃
10.Stopthereaction：AddStopSolution50μltoeachwell,Stopthereaction(thebluecolorchangetoyellowcolor).
11.assay：takeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin15min.
Determinetheresult
Testvalidity:theaverageofPositivecontrolwell≥1.00;theaverageofNegativecontrolwell≤0.10.
CalculateCritical(CUTOFF):Critical=theaverageofNegativecontrolwell+0.15.
Negativecontrol:sampleOD<CalculateCritical(CUTOFF)isAIRANegativecontrol.
Positivecontrol:ampleOD≥CalculateCritical(CUTOFF)isAIRAPositivecontrol.
Importantnotes
1.Pleaseaccordingtouseinstructionstrictly,Donotmixreagentswiththosefromotherlots.
2.Thekittakesoutfromtherefrigerationenvironment首ldbebalanced15-30minutesintheroomtemperaturethenuse,ELISAplatescoatedifhasnotuseupafteropened,theplate首ldbestoredinSealedbag.
3.washingbufferwillCrystallizationseparation,itcanbeheatedthewaterhelpsdissolvewhendilute.Washingdoesnotaffecttheresult.
4.Closureplatemembraneonlylimitsthedisposableuse,inordertoavoidtheoverlappingpollution
5.Thesubstratepleaseevadethelightpreservation.
6.Thetestresultdeterminationmusttakethemicrotiterplatereaderasastandard,whenusedual-wavelengthtoassay,Referencewavelengthis630nm.
7.Allsamples,washingbufferandeachkindofreject首ldaccordingtoinfectivematerialprocess.StoppSolutionis2Msulphuricacid.Youmustpayattentiontosafewhenuse.
Storageandvalidity
1．Storage：2-8℃.
2．validity：sixmonths.

注：内容供参考，具体产品信息请来电或在线咨询。

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