神经胶质细胞培养实验

实验方法原理

神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。

实验材料

大鼠

试剂、试剂盒

MEMFBS胰酶EDTAD-Hanks’液

仪器、耗材

眼科剪滴管离心机培养皿CO2培养箱

实验步骤

一、实验步骤

1.SD大鼠经低温麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒，无菌操作下，断头放入预冷的D-Hanks’液中，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。

2.剪碎组织成1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3.随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的MEM＋10%FBS(GlialMedium，GM)的离心管内终止消化液作用5min。

4.吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5.所得上清于800rpm离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液并吹打成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度1.5×105/cm2种入25cm2培养瓶，放入孵箱培养。以后每隔2～3d进行全量换液。

6.摇床振摇分离星形胶质细胞和少突胶质细胞：培养至7～10天，换液后放入孵箱继续培养24h，取出拧紧培养瓶盖，于37℃恒温摇床上280rpm摇动18h。此时寡突胶质细胞90%以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。

7.分离培养悬液内的少突胶质细胞：吸出悬液至离心管内950rpm离心10min，弃上清后管内加入新鲜GM，吹打成单细胞悬液，按1.5×105/cm2种入预先用100g/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。24h后换成DF12＋N2的无血清培养液，此后每三天半量换液1次。

8.瓶底星形胶质细胞的继续培养：25cm2培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks’液洗2次后常规传代，以1.5×105/cm2种入预先用100g/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。培养液为GM，每三天半量换液1次。附GFAP鉴定星形胶质细胞图片。

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