疯牛病发光免疫测定方法

Prionics-CheckLIA（1uminescenceimmunoassay）是PrionicsAG公司在Prionics-CheckWestern的基础上开发出来的一种新的疯牛病诊断方法，即发光免疫试验。该方法是世界上第二代BSE诊断技术中的Z快速的检测方法，也是diyi个完全适合于自动化的方法，1999年通过欧盟认证。Prionics~-CheckLIA方法可以让实验室在短期内以少量人员的投入而完成高通量的工作，即特别适用于每天检测数百个样品的实验室。另外，自溶的脑组织也可以用本方法来检测，并且完全的自动化可以减少操作中的失误和感染BSE的风险。

本方法的原理是将PK酶消化处理过的脑匀浆与酶标PrP单抗孵育，反应结合物转移到包被有另一种PrP单抗的捕获板内，然后加入发光底物并读数判定结果。整个反应时间约需4．5h，特异性和敏感性均为100％。

的主要步骤如下。

（1）采样将牛头从牛体上取下来以后，用小剪刀尽量往里剪开枕骨大孔延髓部的脑膜，然后用一个手指（带两层手套）把延髓部脑组织与头部相连的神经和血管弄断。一切准备好后将采样勺从枕骨大孔处紧贴颅壁（避免损伤脑组织）伸入颅内，大约伸入10cm深左右停止，紧贴颅壁转动采样勺，转一圈后将采样勺转到与地面平行时用力往下或往上撬，同时往外抠，延髓部脑组织便会掉出颅腔。当然，也可以采用与免疫组织化学方法相同的采样方式，不过检测部位shou选为脑闩部。

（2）样品制备称取0．5g脑闩组织放入匀浆管，加入10倍于（即5mi）该组织的匀浆工作液，用超声波或其他匀浆仪器制备成脑组织悬液。之后取出lml脑匀浆液转移到检测板（深孔板）。

（3）PK酶消化从检测板每孔中各取出100／~L脑匀浆液加入到白色的消化板中，然后分别在每孔中加入50rtlPK酶消化液，混匀，用密封膜密封，47~C孵育60min。消化完后，每孔中加入10t~L消化阻止液，并混匀。

（4）孵育在预孵板（蓝色）的前两道加入30~tL配好的标准对照样品（强阳性、弱阳性和阴性），然后在其他孔中每孔加入15~tL检测缓冲液，再加入15ltl消化过的样品，混匀。在每孔中加入10,aL预孵缓冲液，室温下孵育2min。之后，在每孔中加入200uL稀释好的检测抗体，用密封膜密封，室温下孵育60rain，并以500r／min不断摇动。

（5）捕获、从预孵板中每孔取出200rtl样品加入到捕获板（黑色），用密封膜密封，室温下孵育90min，并以500r／rain不断摇动。

（6）检测用洗板缓冲液洗板，洗完后在每孔中加入100aL发光底物工作液，孵育5min，然后用MPL2读板。

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